System ciągłego wlewu leków w modelu mysim: zabieg chirurgiczny polegający na wszczepieniu systemu infuzyjnego pompy mikroosmotycznej w mózg myszy w celu ciągłego dostarczania leków

Streszczenie

Źródło: Ajoy, R., Chou, S. Y. Badanie sygnału insuliny podwzgórzowej do obwodowej nietolerancji glukozy za pomocą systemu ciągłego wlewu leków do mózgu myszy. J. Vis. Exp. (2018)

W tym filmie demonstrujemy montaż systemu infuzji mózgu za pomocą mikropompy osmotycznej, a następnie jego chirurgiczną implantację w czaszce myszy. System ten umożliwia ciągłe dostarczanie potencjalnych leków i ułatwia badanie ich wpływu na mózg i tkankę mózgową.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Przygotowanie systemów infuzyjnych z mikropompą osmotyczną

UWAGA: Przygotuj pompę, bufor sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (aCSF) i lek (roztwór białka Met-CCL5/RANTES (10 ng/ml w aCSF)) w sterylnych warunkach, używając przefiltrowanych filtrami 0,2 μm i przeprowadź wszystkie procedury pod kapturem hodowlanym w rękawiczkach. Zabiegi chirurgiczne przeprowadza się w następujący sposób:

1. Przygotuj pompy mikroosmotyczne na dzień przed zabiegiem: Napełnij pompę mikroosmotyczną mózgu sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym (aCSF) za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml i igły z główką dostarczonych wraz z zestawem. Zanurz pompę mikroosmotyczną w płynie CSF, umieść ją na shakerze i delikatnie wstrząśnij przez noc.
   UWAGA: Pompę należy napełnić płynem CSF i unikać pęcherzyków powietrza wewnątrz pompy (Rysunek 1A).
2. Przed rozpoczęciem operacji należy przygotować rekombinowany roztwór białka Met-CCL5/RANTES (10 ng/ml, rozcieńczony w aCSF) do wykorzystania w eksperymencie. Usunąć płyn CSF z pompy i powoli napełniać pompę roztworem leku, aż nadmiar wycieknie.
   UWAGA: 15 ml roztworu aCSF lub Met-CCL5/RANTES wystarcza na 5-8 pomp.
   UWAGA: Powtórz procedurę, aby upewnić się, że pompa jest całkowicie wypełniona lekiem bez pęcherzyków w środku.
3. Przyciąć rurki cewnika na żądaną długość i przymocować je igłą do infuzji mózgu w zestawie do infuzji mózgu. Napełnij zestaw infuzyjny i probówki lekiem.
4. Na koniec zmontuj i podłącz zestaw do infuzji mózgu do pompy mikroosmotycznej.
   UWAGA: W rurze ani pompie nie powinny tworzyć się pęcherzyki powietrza (Rysunek 1A).
5. Zanurz cały zestaw do fuzji pompy osmotycznej i mózgu w CSF w wysterylizowanej probówce o pojemności 50 ml, aby zapobiec wysychaniu pompy. Zestaw do fuzji pompy osmotycznej z mózgiem jest teraz gotowy do użycia podczas operacji.
   UWAGA: Systemy pomp mikroosmotycznych mogą być używane do długotrwałego wlewu leków. Zapewnia to bezpieczny i wygodny sposób dostarczania leku do mózgu myszy.

2. Chirurgia komorowa śródmózgowa – wszczepienie mikropompy osmotycznej

UWAGA: Wysterylizuj środowisko chirurgiczne za pomocą 75% etanolu i upewnij się, że osoby biorące udział w badaniu noszą sterylne rękawiczki i czysty fartuch laboratoryjny. Narzędzia/instrumenty chirurgiczne muszą być autoklawowane i suszone przed użyciem, a następnie sterylizowane 75% etanolem pomiędzy operacjami na myszach.

1. Zważ mysz i znieczul ją za pomocą wstrzyknięcia dootrzewnowego (IP) z ketaminą/ksylazyną (ketamina 50 mg/kg, ksylazyna 10 mg/kg).
   UWAGA: Masy ciała myszy o masie ciała mniejszej niż 24 g nie są zalecane do operacji implantacji pompy osmotycznej.
2. Zamontuj i zamocuj głowicę myszy na aparacie stereotaktycznym (Rysunek 1B).
3. Użyj nożyczek chirurgicznych i szczypiec, aby rozciąć zewnętrzną skórę pokrywającą czaszkę. Użyj jodu do oczyszczenia czaszki obwodowej.
4. Oddziel najbardziej zewnętrzną warstwę skóry od skóry podskórnej za pomocą pary szczypiec z głową w pobliżu okolicy szyi w celu implantacji zestawu do fuzji pompy osmotycznej i mózgu (ryc. 1C).
5. Oznaczyć punkt infuzji w odniesieniu do mapy mózgu (ryc. 1D) za pomocą aparatu stereotaktycznego. W tym eksperymencie igła musi zostać wszczepiona w obszar 3. komory (Bregma: 0,0 mm boczny, 1,3 mm tylny, 5,7 mm brzuszny).
6. Wywierć otwór za pomocą wiertła do gwoździ wokół obszaru zaznaczonego na czaszce (Rysunek 1E).
   UWAGA: Uważaj, aby nie uszkodzić opon mózgowych i naczyń krwionośnych myszy, unikając w ten sposób przerwania mikronaczyń krwionośnych w mózgu.
7. Umieść zestaw do fuzji mikro-osmotycznej pompy i mózgu zawierający CSF (jako kontrolę) lub lek (roztwór białka Met-CCL5 / RANTES) pod skórą za obszarem szyi i włóż igłę do infuzji mózgu do wywierconego otworu, aby wprowadzić lek do mózgu myszy (ryc. 1E). Igła przebije opony mózgowe i dostanie się do komory. Zamocuj igłę na czaszce za pomocą żelu odczulającego powierzchnię (ryc. 1F) i odczekaj 1-2 minuty, aż klej wyschnie. Następnie odetnij wystającą część na górze igły (Rysunek 1G-H).
8. Użyj kleju do tkanek, aby zagoić ranę pooperacyjną na głowie. Nałóż 50 μl kleju na wierzch rany, ściągnij obie strony skóry do siebie i przytrzymaj przez 30 sekund, aby skóra się uszczelniła (Rysunek 1I).
   UWAGA: Użyj 100% wacika nasączonego alkoholem do oczyszczenia rany po operacji i 100 ul penicyliny ze streptomycyną, aby zapobiec infekcji. UWAGA: Skóra myszy utworzy tkankę bliznowatą i zagoi się w ciągu kilku dni po podaniu kleju chirurgicznego. Główną zaletą kleju jest uniknięcie stosowania szwów chirurgicznych, które mogą powodować podrażnienia lub stany zapalne skóry.
9. Umieść mysz w czystej klatce umieszczonej na ciepłym talerzu (podgrzanym do 37 °C) i poczekaj, aż mysz wyzdrowieje po działaniu znieczulającym.
   UWAGA: Bardzo ważne jest utrzymanie temperatury ciała myszy, aby zwiększyć szansę na przeżycie po operacji.
10. Po tygodniowym okresie rekonwalescencji myszy będą gotowe do dalszych eksperymentów, takich jak doustny test tolerancji glukozy (OGTT) i test tolerancji insuliny (ITT).

Wyniki

Rysunek 1. Przygotowanie pompy osmotycznej i zabieg chirurgiczny implantacji u myszy. (A) Zestaw do infuzji mózgu i preparat pompy wypełnione roztworem leku. Czerwone strzałki wskazują rurki cewnika wypełnione płynem. (B) Zamocuj i zamontuj głowicę myszy na aparacie stereotaktycznym. (C) Oddzielić najbardziej zewnętrzną warstwę skóry od skóry podskórnej w celu wszcz...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Klej do tkanek Vetbond	3 mln	#1049SB	Klej używany do uszczelnienia miejsca zmiany chorobowej na głowie myszy
LOCTITE 454 klej błyskawiczny	Korporacja Durect	Numer katalogowy #8670	Klej używany do mocowania igły na czaszce myszy
Pompa mikroosmotyczna Alzet	Korporacja Durect	#9922	0,11 μl na godzinę, 28 dni
System infuzji mózgu	Korporacja Durect	#8851	1-3 mm, używane do perfuzji leku do mózgu myszy
MIO NE116 JEDNOSTKA STERUJĄCA (frez do gwoździ)	System Mio	#E235-015	Aby wywiercić dziurę w czaszce myszy
Formuła aCSF	119 mM NaCl 26,2 mM NaHCO3 2,5 mM KCl 1 mM NaH2PO4 1,3 mM MgCl2 10 mM glukozy		Filtr sterylizować za pomocą aparatu filtrującego 0,22 μm i przechowywać w temperaturze 4°C. aCSF jest stabilny przez 3-4 tygodnie

powiedział: