$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Przygotowanie myszy i wprowadzenie cewnika do żyły szyjnej
UWAGA: Tutaj użyto męskich lub żeńskich, 5-7-tygodniowych myszy reporterowych mTmG (B6.129(Cg) Gt(ROSA)26Sortm4(ACTBtdTomato,-EGFP)Luo10) skrzyżowanych z myszami Pf4-cre, co umożliwiło intensywne znakowanie fluorescencyjną na zielono w megakariocytach i płytkach krwi. Przed rozpoczęciem eksperymentu podgrzej komorę grzewczą mikroskopu przez kilka godzin.
- Przenieś mysz do sali obrazowania i przystąp do znieczulenia.
- Znieczulić mysz przez dootrzewnowe (i.p.) wstrzyknięcie roztworu ketaminy (ketamina (100 μg/g) i ksylazyna (10 μg/g) (5 μl/g).
nuta: Wielokrotne podawanie ketaminy/ksylazyny jest tutaj stosowane i działa dobrze, ale wymaga przerwania nagrywania w celu regularnego ponownego wstrzyknięcia. Alternatywnie, jeśli dostępny jest aparat do znieczulenia, indukcja znieczulenia może być przeprowadzona za pomocą ketaminy/ksylazyny, a następnie utrzymywana we wdychaniu gazów (mieszanina izofluranu, powietrza i tlenu).
- Umieść zwierzę w klatce, aż osiągnie głębokie znieczulenie. Umieść mysz na rozgrzanej płycie rozgrzanej w temperaturze 37 °C do wszystkich kolejnych manipulacji.
nuta: Gdy zwierzę osiągnie głęboką narkozę, włącz mikroskop i cały sprzęt oraz ustaw różne parametry potrzebne do rozpoczęcia eksperymentu po zakończeniu operacji. W tym przypadku zabieg trwa tylko 3 godziny i jest nieuleczalny. Mysz jest poddawana eutanazji po eksperymencie bez budzenia się. W związku z tym wystarczająca jest dezynfekcja skóry i narzędzi etanolem. Jednak w zależności od wytycznych instytucjonalnych lub jeśli procedura będzie trwała dłużej, należy zastosować bardziej kompleksowe metody dezynfekcji, takie jak trzy naprzemienne peelingi z betadyną/powidonem i alkoholem.
2. Zainstaluj cewnik w żyle szyjnej.
UWAGA: Ważne jest, aby w miarę możliwości unikać skażenia mikrobiologicznego podczas zabiegu. Należy pamiętać, aby dokładnie zdezynfekować skórę 70% etanolem (EtOH) przed przystąpieniem do zabiegu. Zawsze używaj wysterylizowanych nożyczek i pęsety i regularnie płucz je w 70% EtOH. Pracuj w czystym miejscu i noś maseczkę na twarz. Cewnik "nabiegunowy" o sile 22 g, składający się z igły umieszczonej w plastikowej rurce, służy do wstrzykiwań dożylnych (patrz Tabela materiałów).
- Umieść mysz na plecach i przymocuj przednie nogi taśmą chirurgiczną, aby rozciągnąć gardło (ryc. 1A). Zdezynfekuj gardło 70% etanolem.
nuta: Dla wygody gardło można ogolić przed operacją. Jeśli zabieg trwa dłużej, należy wykonać staranne golenie, aby zapewnić prawidłową technikę aseptyczną.
- Wykonaj 0,7-1 cm nacięcie nad prawą lub lewą żyłą szyjną za pomocą sterylnych nożyczek. Rozciągnij sąsiednią tkankę łączną, aby odsłonić zewnętrzną żyłę szyjną i górną część mięśnia piersiowego (ryc. 1A).
- Napełnij cewnik ciepłą, sterylną solą fizjologiczną. Wprowadzić cewnik do żyły po przeniknięciu przez mięsień piersiowy (ryc. 1B).
nuta: Należy uważać, aby uniknąć pęcherzyków powietrza wewnątrz cewnika. Ważne jest, aby wprowadzić cewnik przez mięsień, aby zapobiec krwotokowi, ponieważ mięsień utworzy punkt kompresji. Nawet myszy z wadami hemostazy, takie jak myszy Itgb3-/-, nie krwawią po wprowadzeniu cewnika przy tym podejściu.
- Delikatnie wyjmij igłę i, jeśli to konieczne, ostrożnie wsuń cewnik głębiej do żyły. Podłączyć strzykawkę i ustabilizować cewnik, dodając kroplę kleju chirurgicznego (tabela materiałów).
nuta: Możliwe jest wprowadzenie cewnika do żyły ogonowej, chociaż wymaga to pewnej wprawy, ponieważ żyła ma mniejszy kaliber. Jest to szczególnie trudne w przypadku myszy o ciemnych włosach, których żyła ogonowa jest ledwo widoczna. Ze względu na większy kaliber, umieszczenie cewnika wewnątrz żyły szyjnej może pozwolić na bardziej niezawodne wstrzykiwanie większych objętości lub powtarzanych zabiegów. Należy pamiętać, że strzykawka jest napełniana po raz pierwszy ciepłym roztworem soli fizjologicznej i nie należy zapominać o wstrzyknięciu martwej objętości przed wstrzyknięciem roztworu leku.
- Ostrożnie ustaw mysz w pozycji leżącej (Rysunek 1C). Nałóż żel (tabela materiałów) na oczy, aby zapobiec wysuszeniu.
