Obrazowanie przyżyciowe: metoda obserwacji trzustki myszy na poziomie komórkowym przez ustabilizowane okno obrazowania

Abstract

Źródło: Park, I. i Kim, P. Stabilizowana podłużna wizualizacja trzustki na poziomie komórkowym in vivo w modelu mysim z oknem obrazowania przyżyciowego trzustki. J. Vis. Exp. (2021).

W tym filmie opisujemy obrazowanie trzustki myszy w trybie przyżyciowym przez ustabilizowane okno do długoterminowej wizualizacji dynamiki komórkowej.

Protocol

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Obrazowanie przyżyciowe

1. Włącz mikroskop przyżyciowy, w tym moc lasera.
2. Włącz poduszkę grzewczą i ustaw regulację hometermiczną na 37 °C.
   nuta: Alternatywnie, użyj pasywnej poduszki grzewczej lub lampy z częstą kontrolą, jeśli nie ma regulacji homeotermicznej.
3. Weźmy mysz z wszczepionym oknem trzustkowym. Wykonać znieczulenie domięśniowe mieszaniną tiletaminy/zolazepamu (30 mg/kg) i ksylazyny (10 mg/kg).
   nuta: Zaleca się stosowanie tiletaminy/zolazepamu zamiast ketaminy ze względu na jej niekorzystny wpływ na hiperglikemię. Do celów eksperymentów należy dobrać optymalne znieczulenie.
4. Wprowadzić cewnik naczyniowy do wstrzyknięcia.
   1. Uciskaj bliższą stronę ogona palcem wskazującym i trzecim jako alternatywę dla zakładania opaski uciskowej. W razie potrzeby podgrzej ogon lampą.
   2. Wysterylizuj żyłę ogonową za pomocą sprayu z 70% etanolem.
   3. Wprowadzić cewnik 30 G do żyły ogonowej bocznej. Niedomykalność krwi zostanie uwidoczniona w probówce PE10.
   4. Nałóż jedwabną taśmę na cewnik, aby go ustabilizować.
   5. Wstrzyknąć dekstran FITC/TMR lub inne sondy fluorescencyjne (25 μg anty-CD31 sprzężonego z Alexa 647), w zależności od kombinacji sond fluorescencyjnych.
      nuta: W przypadku fluorescencyjnych sond z przeciwciałami sprzężonymi wstrzyknąć 2 godziny przed sesją obrazowania.
5. Przenieś mysz z platformy chirurgicznej na etap obrazowania.
6. Włóż sondę doodbytniczą, aby automatycznie kontrolować temperaturę ciała za pomocą homeotermicznego systemu poduszek grzewczych.
7. Włożyć okienko do obrazowania trzustki do uchwytu okienka przygotowanego podczas zakładania mikroskopii przyżyciowej (ryc. 1). W przypadku mikroskopu odwróconego uchwyt na okienko może nie być wymagany.
8. Wykonaj obrazowanie przyżyciowe.
   1. Do obrazowania trzustki należy zacząć od soczewki obiektywowej o małym powiększeniu (np. 4x) do skanowania całego widoku trzustki w oknie obrazowania trzustki (zalecane pole widzenia: 2500 x 2500 μm).
   2. Po określeniu obszaru zainteresowania przełącz się na soczewkę obiektywu o większym powiększeniu (20x lub 40x), aby wykonać obrazowanie na poziomie komórkowym (zalecane pole widzenia: 500 x 500 μm lub 250 x 250 μm). W tym eksperymencie rozdzielczość boczna i osiowa wynosiła odpowiednio około 0,5 μm i 3 μm.
   3. Wykonaj obrazowanie stosowe z lub poklatkowe, aby obserwować strukturę 3D lub dynamikę na poziomie komórkowym, taką jak migracja komórek.
      nuta: W przypadku obrazowania komórek transgenicznych zwierząt transgenicznych z ekspresją białka fluorescencyjnego (MIP-GFP) 30 s przerywanej ekspozycji na laser o długości fali 488 nm i mocy do 0,43 mW było tolerowane bez zauważalnego fotowybielania lub uszkodzenia tkanek. W przypadku obrazowania białek fluorescencyjnych znakowanych za pomocą Alexa 647 moc lasera 640 nm do 0,17 mW była tolerowana bez zauważalnego fotowybielania lub uszkodzenia tkanek. Długotrwała ekspozycja lasera wzbudzającego o mocy powyżej tego ustawienia może prowadzić do fotowybielania lub uszkodzenia tkanek przez fototoksyczność. Dostosuj odpowiednie wzmocnienie i moc, aby odpowiednio zobrazować obszar zainteresowania. Szczegółowe ustawienie parametrów w mikroskopii przyżyciowej musi być zindywidualizowane dla każdej mikroskopii przyżyciowej przygotowanej w instytucie.

Results

Rycina 1: Zdjęcie przedstawiające wykonanie okienka obrazowania przyżyciowego trzustki.Okienko obrazowania przyżyciowego trzustki jest wszczepiane myszy w stadium translacyjnym XYZ, a uchwyt komory obrazowania przymocowany do uchylnego mocowania jest podłączony do okienka obrazowania trzustki. Copyright 2020 Koreańskie Stowarzyszenie Diabetologiczne z Diabetes Metab J. 2020 44:1:193-198. Przedruk za...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Estry sukcynimidylowe Alexa Fluor 647 (estry NHS)	Invitrogen	A20006	Sonda fluorescencyjna do koniugatu z przeciwciałem
Rurki polietylenowe BD Intramedic	BD Nauki biologiczne	427401	Cewnik PE10 do połączenia z igłą
C57BL/6N	OrientBio	C57BL/6N	C57BL/6N
Okulary nakrywkowe okrągłe	Lotnisko Marienfeld	0111520	Szkło nakrywkowe do okienka obrazowania trzustki
FITC Dekstran 2MDa	Merck (dawniej Sigma Aldrich)	FD200S	Do identyfikacji statków
IMARIS 8.1	Płaszczyzna bitowa	IMARIS	Przetwarzanie obrazu
Mikroskopia przyżyciowa	Technologia IVIM	Metoda IVM-C	Mikroskopia przyżyciowa
MIP-GFP (Międzynarodowa Organizacja Zarządzania Finansami)	Laboratorium Jacksona	006864	Klasa B6. Cg-Tg(Ins1-EGFP)1Hara/J
Okno obrazowania trzustki	Inżynieria Geumto	Na zamówienie	Okno obrazowania trzustki - na zamówienie
Apartament fizjoterapeutyczny	Naukowy Kent	Zobacz materiał PS-02	Hometermiczny regulator temperatury
TMR Dekstran 65-85kDa	Merck (dawniej Sigma Aldrich)	Zobacz materiał T1162	Do identyfikacji statków
Uchwyt na okno	Inżynieria Geumto	Na zamówienie	Uchwyt okienny - na zamówienie
Zoletil powiedział:	Wirus Virbac	Zoletil 100	Środek znieczulający
Rompun	Bayer	Rompun	Środek znieczulający