Model perfuzji antegrade: technika ex vivo perfuzji izolowanego serca myszy

Streszczenie

Źródło: Omatsu-Kanbe, M. et al., An Antegrade Perfusion Method for Cardiomyocyte Isolation from Mys. J. Vis. Exp. (2021).

Ten film opisuje technikę perfuzji skierowanej do przodu izolowanego serca myszy, podczas której perfuzat jest wstrzykiwany przez lewą komorę, a ostatecznie przenika cały mięsień sercowy. Metoda ta może być wykorzystana do izolowania kardiomiocytów od modeli mysich i generowania pozbawionych komórek serc do dalszych zastosowań.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Antegrade perfuzja serca myszy

UWAGA: Plastikowa pipeta transferowa używana do ssania serca powinna być miękka i nie powinna być ostro zwężana w kierunku końcówki. Wybierz mały zacisk naczyniowy z ząbkowaniem. Zalecane instrumenty są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Wycięcie serca myszy i zaciśnięcie aorty
   nuta: Dorosłe myszy (>8 tygodni) powinny zostać poddane eutanazji przez przedawkowanie pentobarbitalu sodu (>300 mg/kg, wstrzyknięcie dootrzewnowe [i.p.]) z heparyną (8000 jednostek/kg).
   1. Szybko wytnij serce myszy, ssąc.
      1. Szybko otwórz klatkę piersiową, aby odsłonić serce. Przeciąć plastikową pipetę transferową, której końcówka jest w przybliżeniu tego samego rozmiaru lub nieco mniejsza niż odsłonięte serce (zwykle w miejscu około 1 cm od oznaczenia 0,5 ml w kierunku końcówki, ale zależy to od rozmiaru serca).
      2. Zassaj serce do pipety, podnieś pipetę, aby zrobić wystarczająco dużo miejsca na włożenie nożyczek, i wytnij serce zakrzywionymi nożyczkami od strony grzbietowej, unikając uszkodzenia przedsionków.
      3. Natychmiast przenieś wycięte serce do szklanej zlewki o pojemności 30 ml zawierającej schłodzony lodem CIB-EGTA, aby zatrzymać skurcz. Ta procedura trwa zwykle <1 min.
   2. Czyszczenie okolic aorty
      1. Przenieś serce do 35-milimetrowego naczynia hodowlanego wypełnionego chłodzonym lodem CIB-EGTA i usuń płuca i inne widoczne tkanki, a następnie przenieś z grubsza oczyszczone serce do stojaka na serce wypełnionego schłodzonym CIB-EGTA i umieść je wierzchołkiem w dół.
      2. Pod mikroskopem stereoskopowym usuń tłuszcz i tkankę łączną, aby oczyścić okolice aorty. Jeśli długość przeciętej aorty jest zbyt długa, w tym tętnica ramienno-głowowa, lewa tętnica szyjna wspólna lub lewa tętnica podobojczykowa, odetnij aortę tuż pod tętnicą ramienno-głowową, aby ją skrócić, aby przejść do następnego kroku. Ta procedura trwa zwykle około 4 minut
   3. Zaciśnięcie aorty i umieszczenie zaciśniętego serca na płytce perfuzyjnej
      1. Wprowadzić igłę do wstrzykiwań i rozpocząć perfuzję w celu uwolnienia krwi
         1. Pod mikroskopem umieść serce w stojaku na serce. Operator powinien skierować się w stronę przedniej powierzchni serca, podnieść koniec aorty pęsetą i zacisnąć aortę w pobliżu przedsionków małym zaciskiem naczyniowym, delikatnie dociskając nieco aortę.
         2. Umieść zaciśnięte serce na płytce perfuzyjnej przednią stroną do góry, a następnie przykryj je kilkoma kroplami CIB-EGTA, aby nie wyschło. Ta procedura trwa zwykle <20 s.
      2. Perfuzja serca
         nuta: Najpierw wykonaj perfuzję serca za pomocą CIB-EGTA, aby rozładować krew i zapobiec krzepnięciu.
         1. Wprowadzić igłę do wstrzykiwań i rozpocząć perfuzję w celu uwolnienia krwi
            1. Ustawić strzykawkę o pojemności 20 ml wypełnioną wstępnie podgrzanym CIB-EGTA podłączoną do elastycznej rurki przedłużającej i oznaczonej igły do wstrzykiwań na pompie infuzyjnej. Uruchom pompę z małą prędkością 0,5 ml/min, aby ostrożnie napełnić igłę i rurkę CIB-EGTA i upewnić się, że nie dopuścić do przedostania się powietrza do rurki.
            2. Umieścić igłę do wstrzykiwań na płytce perfuzyjnej krótszym bokiem ukośnego kształtu z przodu. Przesuń igłę w kierunku wierzchołka serca, aż zacznie go dotykać, a następnie ostrożnie włóż igłę w pobliżu wierzchołka lewej komory do komory komorowej bez skręcania. Nie odłączać igły od płytki podczas wprowadzania igły.
            3. Obserwuj czerwony znak, aby oszacować głębokość wkłucia igły. Po zakończeniu wprowadzania igły krew wypływająca z tętnicy wieńcowej powinna zacząć być odprowadzana.
            4. Przymocować igłę do wstrzykiwacza na płytce za pomocą taśmy i zwiększyć prędkość pompy do 1 ml/min. Ta procedura trwa zwykle około 30 s. Jeśli perfuzja serca zakończy się powodzeniem, pod mikroskopem można zobaczyć przepływ CIB-EGTA w naczyniach włosowatych tuż pod nasierdziem.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Rura przedłużająca	Top, Japonia	X1-50	Połączyć ze strzykawką i igłą do wstrzykiwań w celu perfuzji skierowanej do przodu.
Mata grzewcza	Natsume Seisakusho, Japonia	KN-475-3-40	Sprzęt do podgrzewania płytki perfuzyjnej.
Pompa infuzyjna	TERUMO, Japonia	TE-311	Pompa strzykawkowa infuzyjna do perfuzji skierowanej do przodu.
Igła iniekcyjna (rozmiar 27)	TERUMO, Japonia	NN-2719S	Igła do wprowadzenia do lewej komory.
Insulina (z trzustki bydlęcej)	Sigma-Aldrich, Stany Zjednoczone	Zobacz materiał I5500	Rozpuścić w 0,1 M HCl.
Plastikowa strzykawka (20 ml)	TERUMO, Japonia	Zobacz materiał SS-20ES	Stosować do infuzji CIB-EGTA.
Zacisk naczyniowy	Karl Hammacher GmbH, Niemcy	HSE 004-35	Mały prosty zacisk naczyniowy służący do zaciskania aorty.
Wszystkie inne odczynniki	Nacalai Tesque, Japonia