Utrwalanie ciśnieniowe izolowanej mysiej zastawki płucnej: procedura izolacji i chemicznego mocowania mysiej zastawki płucnej w zamkniętej konformacji

Streszczenie

Źródło: Liu, Y., et al. Chirurgia i przetwarzanie próbek do korelacyjnego obrazowania mysiej zastawki płucnej. J. Vis. Exp. (2021)

W tym filmie opisujemy procedurę izolacji i chemicznego ustalania wartości płucnej myszy w zamkniętej konformacji poprzez zwiększanie ciśnienia perfuzji.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Wycięcie zastawki płucnej

1. Autoklaw niezbędnych narzędzi potrzebnych do sekcji myszy. Obejmuje to cienkie nożyczki, mikrokleszki, zaciski do mikronaczyń krwionośnych, kleszcze do nakładania zacisków, uchwyty do mikroigieł, nożyczki sprężynowe i zwijacze.
2. Aklimatyzować wszystkie myszy przez minimum 2 tygodnie przed operacją. Wyjmij myszy C57BL/6 w wieku około 1 roku z klatek i zważ, a następnie poddaj eutanazji za pomocą koktajlu ketamina/ksylazyna (3:1 ketamina:ksylazyna, 0,01 ml na g) w przypadku przedawkowania.
3. Umieść mysz w pozycji leżącej grzbietowej na tacy i zabezpiecz jej kończyny taśmą. Po zabezpieczeniu wykonaj torakotomię.
   1. Odsłoń serce, usuwając nadmiar tkanki tłuszczowej i powięzi.
   2. Usunąć prawy przedsionek i przelać przez lewą komorę roztworem soli fizjologicznej o temperaturze pokojowej (0,9% NaCl). Perfuzja powinna trwać około 20 ml w ciągu 30 s. Powoduje to wykrwawienie myszy.
4. Usuń całe serce, przecinając żyłę główną górną, żyłę główną dolną, tętnicę płucną i aortę. Szczególną ostrożność należy zachować w przypadku tętnicy płucnej. Wyciąć około 2 mm powyżej połączenia komorowo-tętniczego, ponieważ będzie ono służyć jako przewód do zwiększania ciśnienia.
5. Usuń lewą i prawą komorę, aby wystawić komory na ciśnienie atmosferyczne. Upewnij się, że struktura pnia płucnego nie powinna zostać naruszona przez usunięcie komór.

2. Ustalanie ciśnienia w zastawce płucnej

1. Rurka do pomiaru ciśnienia w zespoleniu z tętnicą płucną, pozostawiając około 1 mm odległości między połączeniem sinusoidalno-rurkowym a końcem rurki, aby dostosować się do dużych ruchów płatków i pnia płucnego.
2. Podnieś zbiornik do analogicznego ciśnienia fizjologicznego i napełnij go roztworem soli fizjologicznej. Przetestuj system przepływowy, aby upewnić się, że nie ma zatorów ani pęcherzyków powietrza.
3. Podłączyć kran do zespolenia zastawki płucnej i zapewnić odpowiedni przepływ przez rurkę (tj. brak pęcherzyków powietrza) poprzez przełączenie przewodu odpływowego. Gdy przepływ jest odpowiedni, przełączyć odpływ do zespolenia zastawki płucnej i zapewnić ciśnienie w pniu płucnym. Identyfikuje się to po wzdęciu tułowia płucnego.
4. Po potwierdzeniu wzrostu ciśnienia w pniu płucnym należy stopniowo wprowadzać pierwotny roztwór utrwalający (1,25% aldehydu glutarowego, 1,0% paraformaldehydu w 0,15 M kakodylatu), aż roztwór soli zostanie usunięty. Odbywa się to poprzez usunięcie części, około 25% pojemności zbiornika, roztworu soli fizjologicznej i zastąpienie go głównym utrwalaczem.
   ostrożność: Stosowane utrwalacze (paraformaldehyd i aldehyd glutarowy) są wysoce toksyczne i w celu zapewnienia bezpieczeństwa należy nosić odpowiednie środki ochrony osobistej (PPE).
5. Umieść gazę nasączoną utrwalaczem na próbce tkanki, aby zapobiec wysuszeniu.
6. Utrwalacz perfować przez 3 godziny, uzupełniając zbiornik w razie potrzeby, aby utrzymać stałe ciśnienie. Podczas stabilizacji nierzadko zdarza się, że zastawka płucna kurczy się z powodu utrwalenia chemicznego. W takim przypadku należy stale uzupełniać zbiornik pierwotnym utrwalaczem, aby utrzymać ciśnienie fizjologiczne.
7. Przechowywać zastawkę serca w roztworze utrwalającym w temperaturze 4 °C do czasu użycia. Próbki przechowywano przez okres do 1 tygodnia bez zauważalnej różnicy.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
25% aldehyd glutarowy (aq)	Ems	Numer katalogowy: 16210	Podstawowy składnik utrwalający
0,9% wtrysk chlorku sodu	Hospira Inc.	NDC 0409-4888-10
Strzykawka 1 ml	Bd	309659
Strzykawka 10 ml	Bd	309604
Igła 22G	Bd	305156
Kran 3-drogowy	Smiths Medical ASD, Inc	MX5311L
4% paraformaldehyd (aq)	Ems	Nr kat. 157-4-100	Podstawowy składnik utrwalający
Myszy C57BL/6	Laboratoria Jacksona	664	Około 1 roku
Zacisk kleszczowy	Certyfikat FST	00072-14
Kleszcz Dumont #5	Certyfikat FST	Numer katalogowy: 11251-20
Kleszcze Dumont #5/45	Certyfikat FST	Numer katalogowy: 11251-35
Dumont #7 cienki kleszcz	Certyfikat FST	Rozdział 11274-20
Cienkie nożyczki	Certyfikat FST	Numer katalogowy 14028-10
Roztwór soli fizjologicznej (sterylny 0,9% chlorek sodu)	Hospira Inc	NDC 0409-0138-22
Mikroskop chirurgiczny	Księga Leica	Zobacz materiał M80
Uchwyt na igłę/kleszcz Tish	Mikryny	Przekaźnik MI1540
Trymer	Wahl	Numer katalogowy: 9854-500
Szew monofilamentowy poliamidowy, 10-0	AROSkorporacja Instrumentów Urgicznych	TI38402
Szew monofilamentowy poliamidowy, 6-0	AROSkorporacja Instrumentów Urgicznych	Zobacz materiał SN-1956
Wstrzyknięcie chlorowodorku ketaminy	Hospira Inc	NDC 0409-2053
Kwas L-asparaginowy	Sigma-Aldrich	56-84-8	Składnik barwiący
Azotan ołowiu	Ems	Numer katalogowy: 17900	Składnik barwiący
Kakodylan sodu trójwodny	Sigma-Aldrich	Nr kat. 6131-99-3	bufor
Piosenki z włókniny	McKesson Corp.	Numer katalogowy: 94442000
Kleszczyk mikro-adson	Certyfikat FST	Numer katalogowy: 11018-12
Filtr Millex-GP, 0,22 μm, PES 33mm, niesterylny	EMD Milipore	SLGP033NS

TGL SZT. TGL