Generowanie mysiego modelu pętli proksymalnej jelita grubego: procedura chirurgiczna mająca na celu wygenerowanie pętli proksymalnej jelita grubego i pomiar przepuszczalności jelit poprzez wykrycie markerów fluorescencyjnych w surowicy po wstrzyknięciu doświetlnym

Streszczenie

Źródło: Boerner, K. et al. Funkcjonalna ocena przepuszczalności jelit i migracji przeznabłonkowej neutrofili u myszy przy użyciu standaryzowanego modelu pętli jelitowej. J. Vis. Exp. (2021).

W tym filmie opisujemy procedurę chirurgiczną polegającą na generowaniu pętli proksymalnej okrężnicy myszy lub segmentu pcLoop, po której następuje doświetlna iniekcja markerów fluorescencyjnych do segmentu w celu zbadania przepuszczalności nabłonka jelitowego.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Generowanie pętli proksymalnego dwukropka (pcLoop)

1. Przygotowanie skóry: Wyszoruj sierść linii środkowej brzucha wacikami nasączonymi alkoholem lub gąbką z gazy nasączoną 70% etanolem. Nie zwilżaj dużego obszaru futra alkoholem, aby zapobiec hipotermii.
2. Za pomocą nożyczek wykonaj laparotomię w linii środkowej. Wykonaj pionowe nacięcie na środku brzucha (około 2 cm długości) i odsłoń otrzewną. Uważaj, aby nie uszkodzić narządów wewnątrz jamy brzusznej.
3. Umieść wstępnie przyciętą mokrą bawełnianą gazę na odsłoniętej jamie brzusznej.
4. Użyj mokrych bawełnianych wacików, aby zmobilizować i uwidocznić kątnicę. Ostrożnie umieść kątnicę na mokrej bawełnianej gazie.
   nuta: Kątnica jest zlokalizowana w lewym kwadrancie ogonowym jamy brzusznej u większości myszy niezależnie od płci zwierzęcia.
5. Za pomocą mokrych bawełnianych wacików zewnętrznij całe jelito kręte i umieść je na mokrej bawełnianej gazie. Zidentyfikuj proksymalną okrężnicę i dopływ krwi znajdujący się w mezookrężnicy. Zmobilizuj proksymalną okrężnicę i za pomocą kleszczyków z cienką końcówką utwórz pierwszą ligaturę w obszarze wolnym od naczyń w mezookrężnicy w odległości około 0,5 cm od kątnicy (ryc. 1B).
6. Odmierz 2 cm od pierwszej ligatury i utwórz drugą ligaturę w obszarze wolnym od dopływu krwi w jelicie grubym (ryc. 1C).
7. Za pomocą cienkich nożyczek ostrożnie przytnij obok każdego podwiązania, aby wyizolować pcLoop.
   o długości 2 cm nuta: Cienkimi nożyczkami ostrożnie przyciąć obok każdego podwiązania, aby wyizolować 4-centymetrową pętlę jelita krętego, utrzymując nienaruszony dopływ krwi i błonę krezkową., ważne jest, aby odciąć oba końce, aby wyizolować pcLoop, który jest delikatnie oczyszczony z zawartości światła. Ostrożnie przeciąć tkankę okrężnicy i mezookrężnicę, aby zapobiec krwawieniu małych naczyń do światła jelita. W razie potrzeby należy zastosować kauteryzację termiczną, aby ograniczyć krwawienie w miejscu nacięcia.
8. Delikatnie przepłucz pcLoop ciepłym HBSS, aby usunąć kał za pomocą elastycznej żółtej rurki do karmienia dołączonej do strzykawki o pojemności 10 ml (Przygotuj strzykawkę o pojemności 10 ml wypełnioną ciepłym HBSS i podłącz do żółtej rurki do karmienia. Ta strzykawka będzie używana do nawilżania odsłoniętych tkanek podczas operacji).
9. Podwiązywać dwa ścięte końce przepłukanej pętli pcLoop za pomocą jedwabnego szwu.
10. Użyj strzykawki o pojemności 1 ml z igłą 30G, aby powoli wstrzyknąć 200 μl odczynnika, takiego jak FITC-dextrans (1 mg / ml w HBSS). Niewykorzystany roztwór FITC-dekstranu należy chronić przed światłem w celu przygotowania krzywej wzorcowej po pobraniu surowicy). pcLoop napełni się, powodując umiarkowane rozdęcie błony śluzowej (ryc. 1D).
    nuta: Wstrzyknąć odczynnik do światła pcLoop po przeciwnej stronie tętnicy krezkowej. Zapewnij spójność między zwierzętami i utwórz pętlę pcLoop o długości 2 cm, aby zapewnić równomierne rozdęcie błony śluzowej.
11. Użyj mokrych bawełnianych wacików, aby delikatnie umieścić podwiązaną pętlę pcLoop, jelito kręte i kątnicę do jamy brzusznej.
12. Użyj uchwytu na igłę, anatomicznych kleszczyków i niewchłanialnych jedwabnych szwów 3,0 z igłą do odwrotnego cięcia, aby zamknąć ścianę brzucha.
13. Umieść zwierzę w komorze anestezjologicznej o regulowanej temperaturze na okres inkubacji.

Wyniki

Rysunek 1: Model pętli proksymalnej okrężnicy. (A) Schemat modelu pcLoop. Laparotomia medianowa jest wykonywana na myszach w znieczuleniu umieszczonych na tablicy chirurgicznej z kontrolowaną temperaturą. (B) Eksterioryzacja kątnicy (*), bliższej części okrężnicy, mezookrężnicy i jelita krętego. Zidentyfikowano dwa odpowiednie miejsca do podwiązania (1,2). (...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Sprzęt i materiał
Waciki nasączone alkoholem BD	Bd	326895
BD 1ml Strzykawka tuberkulinowa bez igły	Bd	309659
Igła BD PrecisionGlide, 25G x 5/8"	Bd	305122
Igła BD PrecisionGlide, 30G x 1/2"	Bd	305106
Aplikator z bawełnianą końcówką (wacik), 6", sterylny	FisherScientific	25806 2WC
Gąbki z gazy Dynarex wypełnione bawełną, niesterylne, 2 "x 2"	Targi Medex	3249-1
Parownik anestezjologiczny EZ-7000 (system klasyczny, w tym jednostki grzewcze)	Systemy E-Z	EZ-7000
Chusteczki kimowe, małe (chusteczki higieniczne)	FisherScientific	Numer katalogowy: 06-666
Cienkie nożyczki Moria	Certyfikat FST	Numer katalogowy 14370-22
Puralube Maść weterynaryjna, sterylny lubrykant do oczu	Dechra (Głuch)	12920060
Kleszcze pierścieniowe (kleszcze do tkanek)	Certyfikat FST	Numer katalogowy: 11103-09
Roboz Surgical 4-0 Jedwabny pleciony, 100 YD	FisherScientific	NC9452680
Kleszcze Semken (anatomiczne kleszcze)	Certyfikat FST	Rozdział 1108-13
Sofsilk Niewchłanialny powlekany szew pleciony jedwab Rozmiar 3-0, 18 ", igła 19mm długość 3/8 koło odwrotne cięcie	Henryk Schein	Zobacz materiał SS694
Kleszcze studenckie cienkie, kątowe	Certyfikat FST	Numer katalogowy 91110-10
Strzykawka 10ml PP/PE bez igły	Millipore Sigma	Z248029
Odczynniki
Izofluran	Halowęglowodór	Numer katalogowy: 12164-002-25
Izotiocyjanian fluoresceiny, średnia masa cząsteczkowa 4.000	Sigma	Nr kat. 60842-46-8