Opisano metodę transferu genów do rozwijającego się mózgu myszy z wykorzystaniem unikalnej metody chirurgicznej oraz specjalnego kształtu elektrod. Ta wyjątkowa technika umożliwia czasową i przestrzenną transfekcję plazmidowego DNA, co pomoże wielu neuronaukowcom w badaniu rozwoju mózgu.
Artykuł metodologiczny
Elektroporacja myszy in utero: kontrolowana spatiotemporalna transfekcja genów
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Aby zrozumieć funkcję genów eksprymowanych w specyficznych obszarach rozwijającego się mózgu, w tym cząsteczek sygnałowych i cząsteczek kierujących wzrostem aksonów, konieczny jest lokalny transfer genów lub ich nokaut. Celowane wprowadzanie genów (knock-in) lub ich usuwanie (knock-out) w lokalnych obszarach jest możliwe do przeprowadzenia w połączeniu ze specyficzną linią CRE, co jest jednak pracochłonne, kosztowne i czasochłonne. Dlatego prosta metoda transfekcji – technika elektroporacji in utero, którą można przeprowadzić w krótkim czasie – okaże się przydatna do testowania potencjalnych funkcji genów kandydackich przed stworzeniem zwierząt transgenicznych 1,2. Ponadto elektroporacja in utero pozwala na celowanie w obszary mózgu, dla których nie istnieją specyficzne linie CRE, oraz ogranicza śmiertelność zarodkową 3,4. W niniejszej pracy przedstawiamy metodę elektroporacji in utero łączącą dwa różne typy elektrod w celu prostego i wygodnego transferu genów do docelowych obszarów rozwijającego się mózgu. Po pierwsze, unikalna metoda unieruchamiania zarodków za pomocą światłowodu sprawi, że małe zarodki (od E9.5) będą widoczne, co umożliwi celowe wstrzyknięcie roztworu DNA do komór mózgu oraz wprowadzenie elektrod igłowych do docelowego obszaru mózgu 5,6. Wzorowanie mózgu, np. w obszarze kory, zachodzi na wczesnym etapie embrionalnym, dlatego wczesna elektroporacja od E9.5 wnosi istotny wkład w zrozumienie całego procesu wzorowania obszarów. Po drugie, precyzyjny kształt kapilary zapobiega uszkodzeniu macicy podczas wykonywania otworów przez jej wprowadzenie. Ponadto precyzyjny kształt elektrod igłowych uzyskuje się z drutu wolframowego i platynowego, ostrząc go papierem ściernym i izolując lakierem do paznokci 7 – metoda ta jest szczegółowo opisana w niniejszym protokole. Ta unikalna technika pozwala na transfekcję plazmidowego DNA do ograniczonych obszarów mózgu i umożliwi elektroporację małych zarodków. Pomoże to otworzyć nowe możliwości dla wielu naukowców zajmujących się różnicowaniem komórek, migracją komórek i kierowaniem wzrostem aksonów na bardzo wczesnym etapie embrionalnym. Co więcej, technika ta pozwoli naukowcom na transfekcję plazmidowego DNA do głębokich części rozwijającego się mózgu, takich jak wzgórze i podwzgórze, gdzie nie istnieje wiele specyficznych dla regionu linii CRE do analiz funkcji zyskanej (GOF) lub utraconej (LOF).
Protokół
1. Przygotowanie kapilary i roztworu DNA do iniekcji
- Oczyść plazmidowe DNA metodą Maxi-prep lub równoważną, uzyskując stężenie końcowe 2-3 μg/μl. Odmierz 100 μg DNA, dodaj 10 μl barwnika fast green (stężenie zapasowe 1%) oraz bufor TE (roztwór 10mM Tris Base, 1mM EDTA, pH 8.0) i uzupełnij objętość do 100 μl, aby uzyskać końcowe stężenie DNA w mieszaninie do iniekcji wynoszące 1 μg/μl. Stężenie plazmidowego DNA może być zmieniane w zależności od wielkości plazmidu oraz jego wydajności transfekcji, co należy przetestować indywidualnie.
- Wirowarkuj roztwór DNA przez 5 minut przy 14,000 RPM w temperaturze pokojowej i zbierz nadsącz, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia.
- Wytnij szklaną kapilarę za pomocą wyciągarki do mikropipet. Odetnij końcówkę pęsetą tak, aby średnica wierzchołka wynosiła 20–30 μm. Odmierz 800 μm-1 mm od końcówki i sprawdź, czy średnica zewnętrzna jest mniejsza niż 60 μm (Rys. 1A).
- Podłącz kapilarę do mikromanipulatora i wypełnij ją olejem mineralnym. Aby napełnić kapilarę roztworem DNA, zanurz końcówkę w roztworze i zaciągnij roztwór DNA.
2. Przytwierdzanie elektrod platynowych
W niniejszym doświadczeniu zastosowano platynowe elektrody w formie igieł (Nepe gene, CUY611P2-1) do elektroporacji powierzchniowych obszarów mózgu, takich jak kora (Rys. 1F).
3. Przygotowanie mikroelektrod
Użyj mikroelektrod do przeprowadzenia elektroporacji w głębokich obszarach mózgu (tj. w wzgórzu i podwzgórzu) (Rys. 2B-E).
- Jeden koniec drutów wolframowych (dla elektrod ujemnych) i platynowych (dla elektrod dodatnich) owija się wokół pozłacanych pinów i mocuje parafilmem. Drut należy wsunąć w trzonek patyczka higienicznego i owinąć oba końce parafilmem (Rys. 1B).
- Koniec drutu należy równomiernie zaostrzyć papierem ściernym, aż osiągnie średnicę zewnętrzną 20–30 μm oraz 60 μm na odcinku od 800 μm-1 mm od czubka (Rys. 1C i D).
- W celu izolacji należy nanieść na drut cienką warstwę lakieru do paznokci. Po wyschnięciu lakieru należy go usunąć z końcówki (około 200 μm od czubka) za pomocą patyczka higienicznego nasączonego acetonem. Ważna uwaga: Aby zapobiec uszkodzeniu macicy myszy, odcinek w promieniu 800 μm-1 mm od czubka nie powinien przekraczać 70 μm średnicy (Rys. 1E).
4. Przygotowanie do operacji
- Zanurz mysz w stanie ciąży (E9.5-E15.5) w narkozie. Prezentujemy znieczulenie przy użyciu sodowego pentobarbitalu klasy farmaceutycznej (Tabela II; 50 μg na gram masy ciała, wstrzykiwanie domięśniowo i odczekanie 5 min). Alternatywami dla sodowego pentobarbitalu jako środka znieczulającego są iniekcje ketaminy/ksylazyny lub środki znieczulające w formie gazowej (gaz jest preferowany w przypadku procedur o krótkim czasie trwania). Iniekcję należy przeprowadzić z zachowaniem ostrożności, aby uniknąć uszkodzenia organów, w przeciwnym razie może dojść do uszkodzenia macicy lub śmierci zwierzęcia. Po prawidłowo wykonanej iniekcji IP przeżywalność wynosi ponad 95%. Zabieg można również przeprowadzać w środowisku otwartym. Przed rozpoczęciem operacji należy sprawdzić brak reakcji zwierzęcia na uszczypnięcie w palec u nogi, aby potwierdzić działanie znieczulenia.
- Wygolić sierść z brzucha za pomocą żyletki i 50% EtOH. Przygotować skórę, naprzemiennie przecierając ją betadyną i alkoholem (70%).
- Za pomocą precyzyjnych nożyczek wykonać nacięcie w linii środkowej brzucha i ostrożnie wysunąć wszystkie rogi macicy na nawilżoną 37 °C fosforanem sodu w roztworze soli (PBS) gazę bawełnianą, umieszczoną wokół rany. Przez cały czas należy utrzymywać macicę w wilgotnym stanie za pomocą PBS.
- Trzymać elastyczny kabel światłowodowy między palcem wskazującym a środkowym i umieścić go pod rogiem macicy. Przed użyciem oczyścić kabel 70% EtOH. Do wizualizacji nie jest wymagany mikroskop ani lupa. Umieścić macicę pomiędzy światłowodem a kciukiem i delikatnie ścisnąć, aby przesunąć embrion bliżej ściany macicy.
5. Iniekcja DNA i elektroporacja
- Po ustawieniu zarodka, ostrożnie wprowadź szklaną kapilarę do docelowego komory i wstrzyknij ok. 1 μl roztworu DNA (Rys. 2A).
- W przypadku elektroporacji powierzchownych części mózgu, przy użyciu sztywnych elektrod platynowych, umieść elektrody na zewnątrz macicy i przyłóż sugerowane prostokątne impulsy prądu zgodnie z instrukcją producenta (Tabela I). W celu elektroporacji głębszych części mózgu (mikroelektroporacji) stosuje się elektrody igłowe. Wprowadź cienką wolframową elektrodę ujemną do komory, do której wstrzyknięto DNA, a elektrodę platynową do macicy, tak aby obszar docelowy znajdował się pomiędzy dwiema elektrodami, a następnie przyłóż sugerowane prostokątne impulsy prądu (Tabela I) (Rys. 2B).
6. Po elektroporacji
- Umieść róg macicy z powrotem w pierwotnym położeniu i dodaj 500 μL uprzednio ogrzanego do 37 °C PBS.
- Zeszyj warstwę wewnętrzną szwem chirurgicznym, a warstwę zewnętrzną zamknij za pomocą 9 mm autoclipauto clip.
- Umieść zwierzęta na podgrzewaczu przez 2 godziny, aby umożliwić wybudzenie z narkozy. W celu uśmierzenia bólu pooperacyjnego można podać leki przeciwbólowe, takie jak karprofen lub buprenorfina.
7. Reprezentatywne wyniki:
Na rysunku Figure 32 przedstawiono przykłady elektroporacji kory konstruktem pCAG-EYFP przy użyciu platynowych elektrod w różnych punktach czasowych. Mózgi poddano elektroporacji w dniach E13.5, E14.5 i E15.5, a następnie pobrano w 6. dniu postnatalnym (P6). Barwienie przeciwciałem przeciwko RORc ujawnia położenie warstwy 4, natomiast położenie komórek przetransfekowanych EYFP jest widoczne dzięki barwieniu przeciwciałem przeciwko GFP; oba obrazy zostały nałożone na siebie (Rys. 3A i B). Warstwa oznakowanych komórek kory poddanych elektroporacji jest wyraźnie różna w każdym z eksperymentów (Rys. 32), co sugeruje, że elektroporacja zależna od czasu umożliwia uzyskanie specyficzności dla poszczególnych warstw kory w badaniach GOF/LOF.
Żywotność embrionów oraz wydajność transfekcji komórek różnią się w zależności od wieku embrionu i miejsca przeprowadzania elektroporacji. Próbki wymieniono w Tabeli 1, jednak warunki powinny być optymalizowane dla każdej elektroporacji w zależności od stadium i części mózgu.
Elektroporacja w tkankach głębokich, takich jak wzgórze i podwzgórze, z wykorzystaniem sztyftowych elektrod platynowych często charakteryzuje się niską wydajnością (Tabela 1). Problem ten można rozwiązać poprzez zastosowanie mikroelektrod, które docierają do głębokich obszarów mózgu. Rysunek 3 4 przedstawia przykład elektroporacji pCAG-EYFP w rozwijającym się międzymózgowiu. Roztwór plazmidowego DNA wstrzykuje się do 3rd komora w stadium E11.5, a następnie mikroelektroporacja (Rys. 3C4C). Obszar poddany elektroporacji jest ograniczony do wzgórza, gdzie większość aksonów rzutuje do kory (Rys. 3B4B). Projekcje aksonalne do warstwy 4 kory można również zwizualizować za pomocą EYFP, który wypełnia cały neuron.Rys. 3A4A).
Rycina 1. Schematyczna ilustracja przedstawiająca prawidłowy kształt kapilary. (A) Szklana rurka kapilarna jest wyciągana za pomocą wyciągarki do mikropipet w celu uzyskania określonego kształtu. Końcówka jest odcinana pęsetą tak, aby osiągnęła średnicę 20–30 μm. Należy zmierzyć odległość 800 μm-1 mm od końcówki (czerwony nawias) i upewnić się, że średnica zewnętrzna wynosi mniej niż 60 μm (zielony nawias). (B) Jeden koniec drutów wolframowych lub platynowych jest owijany wokół pozłacanych pinów i mocowany parafilmem. Następnie za pomocą papieru ściernego formuje się ich końcówki tak, aby średnica zewnętrzna wynosiła 20-30 μm, a 60 μm w odległości od 1 mm od końcówki. (C) Obraz drutu wolframowego przed formowaniem. (D) Obraz drutu wolframowego po formowaniu. (E) Obraz drutu wolframowego po nałożeniu cienkiej warstwy lakieru do paznokci. Pasek skali na rysunku E wynosi 10 μm (najmniejsza skala) dla rysunków C-E. (F) Elektrody platynowe w formie pręcików (Nepa gene. CUY611P2-1). Pasek skali na rysunku F wynosi 2 mm.
Rysunek 2. Schematyczny rysunek procedury chirurgicznej. (A) Schemat iniekcji do komory bocznej lub dużych embrionów (lewa strona) oraz do 3rd komory lub małych embrionów (prawa strona). (B) Schemat elektroporacji za pomocą platynowej elektrody prętowej (lewa strona) oraz elektrody igłowej (prawa strona).
Rycina 3. Rozwijający się teleencephalon myszy poddano elektroporacji pCAG-EYFP w E13.5 (A), E14.5 (B) i E15.5 (C), a następnie pobrano w P6. Mózgi pocięto w płaszczyźnie czołowej i barwiono oddzielnie przeciwciałem przeciwko GFP lub przeciwciałem przeciwko RORc, a następnie nałożono obrazy na siebie. (A) Elektroporacja plazmidu pCAG-EYFP w E13.5 powoduje transfekcję wielu neuronów warstwy 4, które pokrywają się z markerami warstwy 4 RORc. (B) Elektroporacja plazmidu pCAG-EYFP w E14.5 powoduje transfekcję komórek, które znajdują się bardziej powierzchownie niż neurony warstwy 4. (C) Elektroporacja w E15.5 znakuje wiele neuronów powierzchownych, takich jak neurony warstwy 2/3.
Pasek skali 200 μm.
Rycina 4. Transfekcja EYFP do aksonów wzgórzowo-korowych (TCA). (A) Zakończenia TCA w 4. warstwie kory wykazane za pomocą barwienia przeciwciałem przeciwko GFP. Do wyznaczenia położenia 4. warstwy wykorzystano barwienie przeciwciałem przeciwko RORc. Oba obrazy zostały pobrane z tego samego przekroju i nałożone na siebie. (B) Miejsce elektroporacji we wzgórzu wykazane za pomocą barwienia przeciwciałem przeciwko GFP oraz barwienia RORc, którego ekspresja we wzgórzu jest ograniczona 11. (C) Przedstawiono schematyczny rysunek elektroporacji wzgórza i projekcji TCA. Pasek skali 200 μm.
Dyskusja
W niniejszym protokole opisano jedynie zalety techniki transfekcji pCAG-EYFP do ograniczonego obszaru małego mózgu zarodkowego przy użyciu elektrod o różnych kształtach. Porównanie wydajności transfekcji przy użyciu różnych promotorów, wykazujące specyficzność względem typu komórek, zostało opisane wcześniej 1. Istnieją jednak ograniczenia tej techniki; na przykład transfekcja jest jedynie przejściowa i różni się w zależności od plazmidu, nie wykazuje specyficzności komórkowej, a kontrola liczby przetransfekowanych komórek jest utrudniona. Niemniej jednak połączenie tego protokołu z innymi technikami zapewni dalsze możliwości zastosowania różnych metod manipulacji. Po pierwsze, włączenie do plazmidowego DNA promotora specyficznego dla danej komórki umożliwi transfekcję specyficzną dla typu komórek, takich jak neurony, komórki glejowe i astrocyty. Po drugie, ponieważ transfekcja jest przejściowa, nie jest ona odpowiednia dla naukowców chcących analizować funkcję genu w późniejszym etapie życia. Dlatego połączenie z transpozazą w celu zintegrowania plazmidowego DNA z genomem przekształci ją w transfekcję stabilną 8. Następnie zastosowanie systemu tet-on lub tet-off umożliwi manipulowanie czasem lub specyficzną dla typu komórek ekspresją genów w komórkach nerwowych 8. Alternatywnie protokół ten można połączyć z indukowanymi tamoksyfenem rekombinazami Cre-ER(T) 9 oraz myszami reporterowymi 10.
Szeroka dostępność tkanek drastycznie zmieni projekty eksperymentalne stosowane w neuronauce.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Praca ta była finansowana przez RIKEN Brain Science Institute (BSI), Human Frontier Science Program (HFSP) (grant przyznany T.S.) oraz RIKEN Junior Research Associate Program (JRA, grant przyznany M.K.). RIKEN Brain Science Institute (BSI), Human Frontier Science Program (HFSP) (grant przyznany T.S.) oraz RIKEN Junior Research Associate Program (JRA, grant przyznany M.K.) sfinansowały tę pracę.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| goły drut wolframowy o średnicy 125 μm | A-M Systems | 797600 | |
| goły drut platynowy o średnicy 125 μm | A-M Systems | 767000 | |
| elektrody w formie pręcików | Nepa gene | CUY610P4-1 | |
| szklana rurka kapilarna | Stoelting Co. | 50611 | |
| mikromanipulator | KD Scientific | KDS310 | |
| nożyczki | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5865 | |
| generator impulsów | A-M Systems | Model 2100 | |
| klips autoklawowalny 9 mm | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-9260 | |
| piny pozłacane | World Precision Instruments, Inc. | 5482 | |
| przeciwciało RORc | Perseus Proteomics | H3925 |
Bibliografia
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: Visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103, 865-872 (2001).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental Biology. 240, 237-246 (2001).
- Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8. Science. 294, 1071-1074 (2001).
- Kataoka, A., Shimogori, T. Fgf8 controls regional identity in the developing thalamus. Development. 135, 2873-2881 (2008).
- Imayoshi, I., Shimogori, T., Ohtsuka, T., Kageyama, R. Hes genes and neurogenin regulate non-neural versus neural fate specification in the dorsal telencephalic midline. Development. 135, 2531-2541 (2008).
- Shimogori, T., Banuchi, V., Ng, H. Y., Strauss, J. B., Grove, E. A. Embryonic signaling centers expressing BMP, WNT and FGF proteins interact to pattern the cerebral cortex. Development. 131, 5639-5647 (2004).
- Shimogori, T., Ogawa, M. Gene application with in utero electroporation in mouse embryonic brain. Development Growth & Differentiation. 50, 499-506 (2008).
- Takahashi, Y., Watanabe, T., Nakagawa, S., Kawakami, K., Sato, Y. Avian Embryology. Methods in Cell Biology. Vol 87, 2nd Edition, Elsevier Academic Press Inc. 271-271 (2008).
- Feil, R. Ligand-activated site-specific recombination in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, 10887-10890 (1996).
- Indra, A. K. Temporally-controlled site-specific mutagenesis in the basal layer of the epidermis: comparison of the recombinase activity of the tamoxifen-inducible Cre-ERT and Cre-ERT2 recombinases. Nucleic Acids Research. 27, 4324-4327 (1999).
- Nakagawa, Y., O'Leary, D. D. M. Dynamic patterned expression of orphan nuclear receptor genes ROR alpha and ROR beta in developing mouse forebrain. Developmental Neuroscience. 25, 234-244 (2003).
Przedruki i uprawnienia
