Elektroporacja myszy in utero: kontrolowana spatiotemporalna transfekcja genów

Podsumowanie

Opisano metodę transferu genów do rozwijającego się mózgu myszy z wykorzystaniem unikalnej metody chirurgicznej oraz specjalnego kształtu elektrod. Ta wyjątkowa technika umożliwia czasową i przestrzenną transfekcję plazmidowego DNA, co pomoże wielu neuronaukowcom w badaniu rozwoju mózgu.

Streszczenie

Aby zrozumieć funkcję genów eksprymowanych w specyficznych obszarach rozwijającego się mózgu, w tym cząsteczek sygnałowych i cząsteczek kierujących wzrostem aksonów, konieczny jest lokalny transfer genów lub ich nokaut. Celowane wprowadzanie genów (knock-in) lub ich usuwanie (knock-out) w lokalnych obszarach jest możliwe do przeprowadzenia w połączeniu ze specyficzną linią CRE, co jest jednak pracochłonne, kosztowne i czasochłonne. Dlatego prosta metoda transfekcji – technika elektroporacji in utero, którą można przeprowadzić w krótkim czasie – okaże się przydatna do testowania potencjalnych funkcji genów kandydackich przed stworzeniem zwierząt transgenicznych ^1,2. Ponadto elektroporacja in utero pozwala na celowanie w obszary mózgu, dla których nie istnieją specyficzne linie CRE, oraz ogranicza śmiertelność zarodkową ^3,4. W niniejszej pracy przedstawiamy metodę elektroporacji in utero łączącą dwa różne typy elektrod w celu prostego i wygodnego transferu genów do docelowych obszarów rozwijającego się mózgu. Po pierwsze, unikalna metoda unieruchamiania zarodków za pomocą światłowodu sprawi, że małe zarodki (od E9.5) będą widoczne, co umożliwi celowe wstrzyknięcie roztworu DNA do komór mózgu oraz wprowadzenie elektrod igłowych do docelowego obszaru mózgu ^5,6. Wzorowanie mózgu, np. w obszarze kory, zachodzi na wczesnym etapie embrionalnym, dlatego wczesna elektroporacja od E9.5 wnosi istotny wkład w zrozumienie całego procesu wzorowania obszarów. Po drugie, precyzyjny kształt kapilary zapobiega uszkodzeniu macicy podczas wykonywania otworów przez jej wprowadzenie. Ponadto precyzyjny kształt elektrod igłowych uzyskuje się z drutu wolframowego i platynowego, ostrząc go papierem ściernym i izolując lakierem do paznokci ⁷ – metoda ta jest szczegółowo opisana w niniejszym protokole. Ta unikalna technika pozwala na transfekcję plazmidowego DNA do ograniczonych obszarów mózgu i umożliwi elektroporację małych zarodków. Pomoże to otworzyć nowe możliwości dla wielu naukowców zajmujących się różnicowaniem komórek, migracją komórek i kierowaniem wzrostem aksonów na bardzo wczesnym etapie embrionalnym. Co więcej, technika ta pozwoli naukowcom na transfekcję plazmidowego DNA do głębokich części rozwijającego się mózgu, takich jak wzgórze i podwzgórze, gdzie nie istnieje wiele specyficznych dla regionu linii CRE do analiz funkcji zyskanej (GOF) lub utraconej (LOF).

Protokół

1. Przygotowanie kapilary i roztworu DNA do iniekcji

1. Oczyścić plazmidowe DNA metodą Maxi-prep lub równoważną, uzyskując stężenie końcowe 2-3 μg/μl. Odmierzyć 100 μg DNA, dodać 10 μl barwnika fast green (stężenie zapasowe 1%) oraz bufor TE (roztwór 10mM Tris Base, 1mM EDTA, pH 8.0) i uzupełnić objętość do 100 μl, aby końcowe stężenie DNA w mieszaninie do iniekcji wynosiło 1 μg/μl. Stężenie plazmidowego DNA może być zmieniane w zależności od wielkości plazmidu oraz jego wydajności transfekcji, co należy przetestować indywidualnie.
2. Wirować roztwór DNA przez 5 minut przy 14 000 RPM w temperaturze pokojowej i zebrać nadsącz w celu usunięcia wszelkich zanieczyszczeń.
3. Wytworzyć szklane kapilary za pomocą wyciągarki do mikropipet. Odciąć końcówkę pęsetą tak, aby średnica wierzchołka wynosiła 20–30 μm. Odmierzyć 800 μm-1 mm od końcówki i sprawdzić, czy średnica zewnętrzna jest mniejsza niż 60 μm (Rys. 1A).
4. Podłączyć kapilarę do mikromanipulatora i wypełnić ją olejem mineralnym. Aby napełnić kapilarę roztworem DNA, zanurzyć końcówkę w roztworze i zassać roztwór DNA.

2. Przymocowanie elektrod platynowych

W niniejszym badaniu zastosowano platynowe elektrody w formie prętów (Nepe gene, CUY611P2-1) do elektroporacji powierzchownych obszarów mózgu, takich jak kora (Rys. 1F).

3. Przygotowanie mikroelektrod

Należy zastosować mikroelektrody do przeprowadzenia elektroporacji w głębokich obszarach mózgu (tj. w wzgórzu i podwzgórzu) (Rys. 2B-E).

1. Jeden koniec drutów wolframowych (dla elektrod ujemnych) i platynowych (dla elektrod dodatnich) owija się wokół pozłacanych pinów i mocuje za pomocą parafilmu. Drut należy wsunąć w trzonek patyczka higienicznego i owinąć oba końce parafilmem (Rys. 1B).
2. Koniec drutu należy równomiernie zaostrzyć papierem ściernym, aż osiągnie średnicę zewnętrzną 20–30 μm na odcinku od 60 μm do 800 μm-1 mm od czubka (Rys. 1C i D).
3. W celu izolacji na drut należy nanieść cienką warstwę lakieru do paznokci. Po wyschnięciu lakieru należy usunąć go z końcówki (około 200 μm od czubka) za pomocą patyczka higienicznego nasączonego acetonem. Ważna uwaga: Aby zapobiec uszkodzeniu macicy myszy, część na odcinku 800 μm-1 mm od czubka nie powinna przekraczać 70 μm średnicy (Rys. 1E).

4. Przygotowanie do zabiegu

1. Zanurz mysz w ciąży (E9,5-E15,5) w narkozie. W niniejszej procedurze zastosowano znieczulenie za pomocą sodowego pentobarbitalu klasy farmaceutycznej (Tabela II; 50 μg na gram masy ciała, podać domięśniowo i odczekać 5 min). Alternatywami dla sodowego pentobarbitalu jako środka znieczulającego są iniekcje ketaminy/ksylazyny lub znieczulenia gazowe (znieczulenie gazowe jest preferowane w procedurach o krótkim czasie trwania). Iniekcję należy wykonać ostrożnie, aby nie uszkodzić żadnego z narządów, w przeciwnym razie może dojść do uszkodzenia macicy lub śmierci zwierzęcia. Przy prawidłowo wykonanej iniekcji IP przeżywalność wynosi ponad 95%. Operację można również przeprowadzić w środowisku otwartym. Przed rozpoczęciem zabiegu należy sprawdzić brak reakcji zwierzęcia na uszczypnięcie w palec u nogi, aby potwierdzić skuteczność znieczulenia.
2. Wygolić włosy z brzucha za pomocą żyletki i 50% EtOH. Przygotować skórę, naprzemiennie przecierając ją betadyną i alkoholem (70%).
3. Za pomocą precyzyjnych nożyczek wykonać nacięcie wzdłuż linii środkowej brzucha i ostrożnie wyciągnąć wszystkie rogi macicy na zwilżoną PBS gazę bawełnianą, uprzednio podgrzaną do 37 °C i umieszczoną wokół rany. Przez cały czas utrzymywać macicę w stanie wilgotnym, zwilżając ją PBS.
4. Trzymać elastyczny kabel światłowodowy między palcem wskazującym a środkowym i umieścić go pod rogiem macicy. Przed użyciem oczyścić kabel 70% EtOH. Do wizualizacji nie jest wymagany mikroskop ani lupa. Umieścić macicę pomiędzy światłowodem a kciukiem i delikatnie ścisnąć, aby przesunąć embrion bliżej ściany macicy.

5. Iniekcja DNA i elektroporacja

1. Po ustawieniu zarodka, ostrożnie wprowadź szklaną kapilarę do docelowej komory i wstrzyknij ok. 1 μl roztworu DNA (Rys. 2A).
2. W przypadku elektroporacji powierzchownych części mózgu, przy użyciu stałych elektrod platynowych, umieść elektrody na zewnątrz macicy i zastosuj sugerowane prostokątne impulsy prądu zgodnie z instrukcją producenta (Tabela I). Do elektroporacji głębszych części mózgu stosuje się mikroelektroporację z wykorzystaniem elektrod igłowych. Wprowadź cienką wolframową elektrodę ujemną do komory, do której wstrzyknięto DNA, a elektrodę platynową do macicy, tak aby obszar docelowy znajdował się pomiędzy obiema elektrodami, następnie zastosuj sugerowane prostokątne impulsy prądu (Tabela I) (Rys. 2B).

6. Po elektroporacji

1. Umieścić róg macicy z powrotem w pierwotnym miejscu i dodać 500 μL podgrzanego do 37 °C roztworu PBS.
2. Zszyć warstwę wewnętrzną szwem chirurgicznym, a warstwę zewnętrzną zamknąć za pomocą 9 mm klipsa autoklawowanego.
3. Umieścić zwierzęta na podkładce grzewczej na 2 godziny, aby umożliwić wybudzenie z narkozy. W celu łagodzenia bólu pooperacyjnego można podać leki przeciwbólowe, takie jak karprofen lub buprenorfina.

7. Reprezentatywne wyniki:

Niektóre przykłady elektroporacji kory mózgu konstruktem pCAG-EYFP z użyciem platynowych elektrod prętowych w różnych punktach czasowych przedstawiono na rysunku Figure 32. Elektroporację mózgów przeprowadzono w dniach E13.5, E14.5 i E15.5, a materiał pobrano w 6. dniu postnatalnym (P6). Barwienie przeciwciałem przeciwko RORc ujawnia położenie warstwy 4, natomiast położenie komórek przetransfekowanych EYFP ujawnia barwienie przeciwciałem przeciwko GFP; oba obrazy zostały nałożone na siebie (Rys. 3A i B). Warstwa oznakowanych komórek korowych poddanych elektroporacji jest wyraźnie różna w każdym z eksperymentów (Rys. 32), co sugeruje, że elektroporacja zależna od czasu umożliwia specyficzne dla warstwy kory GOF/LOF.

Żywotność embrionów oraz wydajność transfekcji komórek różnią się w zależności od wieku embrionu i miejsca elektroporacji. Próbki wymieniono w Tabeli 1, jednak warunki powinny zostać zoptymalizowane dla każdej elektroporacji w zależności od stopnia rozwoju i części mózgu.

Elektroporacja tkanek głębokich, takich jak wzgórze i podwzgórze, z wykorzystaniem sztyftowych elektrod platynowych często charakteryzuje się niską wydajnością (Tabela 1). Problem ten można rozwiązać poprzez zastosowanie mikroelektrod, które dotrą do głębokich części mózgu. Rysunek 3 4 przedstawia przykład elektroporacji pCAG-EYFP w rozwijającym się zaświadku mózgowia. Roztwór plazmidowego DNA wstrzykuje się do 3^rd komora w stadium E11.5, a następnie mikroelektroporacja (Rys. 3C4C). Obszar poddany elektroporacji jest ograniczony do wzgórza, gdzie większość aksonów rzutuje do kory (Rys. 3B4B). Projekcję aksonów do warstwy 4 kory można również zwizualizować za pomocą EYFP, który wypełnia cały neuron. (Rys. 3A4A).

Rycina 1. Schematyczna ilustracja przedstawiająca prawidłowy kształt kapilary. (A) Szklana rurka kapilarna jest wyciągana za pomocą wyciągarki do mikropipet w celu nadania jej określonego kształtu. Końcówka zostaje odcięta pęsetą, aby uzyskać średnicę 20–30 μm. Należy odmierzyć 800 μm-1 mm od końcówki (czerwony nawias) i upewnić się, że średnica zewnętrzna jest mniejsza niż 60 μm (zielony nawias). (B) Jeden koniec drucianych elektrod wolframowych lub platynowych jest nawijany na pozłacane piny i mocowany parafilmem. Następnie należy użyć papieru ściernego, aby uzyskać średnicę zewnętrzną końcówki wynoszącą 20-30 μm oraz średnicę 60 μm w odległości 1 mm od końcówki. (C) Obraz drutu wolframowego przed formowaniem. (D) Obraz drutu wolframowego po formowaniu. (E) Obraz drutu wolframowego po nałożeniu cienkiej warstwy laku do paznokci. Pasek skali na zdjęciu E dla obrazów C-E wynosi 10 μm (najmniejsza skala). (F) Prętowe elektrody platynowe (Nepa gene. CUY611P2-1). Pasek skali na zdjęciu F wynosi 2 mm.

Rysunek 2. Schemat graficzny procedury chirurgicznej. (A) Diagram wstrzyknięcia do komory bocznej u dużych embrionów (lewa strona) oraz do 3^rd komora lub małe embriony (prawa strona). (B) Schemat elektroporacji za pomocą platynowej elektrody prętowej (lewa strona) oraz elektrody igłowej (prawa strona).

Rysunek 3. Rozwijający się telencefalon myszy poddano elektroporacji pCAG-EYFP w dniach E13.5 (A), E14.5 (B) oraz E15.5 (C), a następnie pobrano w dniu P6. Próbki mózgu pocięto w płaszczyźnie czołowej i barwiono oddzielnie przeciwciałem przeciwko GFP lub przeciwciałem przeciwko RORc, a następnie nałożono obrazy na siebie. (A) Elektroporacja plazmidu pCAG-EYFP w dniu E13.5 prowadzi do transfekcji wielu neuronów warstwy 4, które pokrywają się z markerem warstwy 4 RORc. (B) Elektroporacja plazmidu pCAG-EYFP w dniu E14.5 prowadzi do transfekcji komórek położonych bardziej powierzchownie niż neurony warstwy 4. (C) Elektroporacja w dniu E15.5 znakuje wiele neuronów powierzchownych, takich jak neurony warstwy 2/3. Pasek skali 200 μm.

Rycina 4. Transfekcja EYFP do aksonów wzgórzowo-korowych (TCA). (A) Zakończenia TCA w 4. warstwie kory zostały uwidocznione za pomocą barwienia przeciwciałem przeciwko GFP. Barwienie przeciwciałem przeciwko RORc służy do wyznaczenia położenia warstwy 4. Oba obrazy zostały wykonane z tego samego przekroju i nałożone na siebie. (B) Miejsce elektroporacji we wzgórzu zostało również pokazane za pomocą barwienia przeciwciałem przeciwko GFP oraz barwienia RORc, którego ekspresja jest ograniczona do wzgórza 11. (C) Przedstawiono schemat elektroporacji wzgórza oraz projekcji TCA. Pasek skali 200 μm.

Dyskusja

W niniejszym protokole opisano jedynie zalety techniki transfekcji pCAG-EYFP do ograniczonego obszaru małego mózgu zarodkowego przy użyciu elektrod o różnych kształtach. Porównanie wydajności transfekcji przy użyciu różnych promotorów, wykazujące specyficzność względem typu komórek, zostało opisane wcześniej ¹. Istnieją jednak ograniczenia tej techniki; na przykład transfekcja jest jedynie przejściowa i różni się w zależności od plazmidu, nie wykazuje specyficzności komórkowej, a kontrola liczby przetransfekowanych komórek jest utrudniona. Niemniej jednak połączenie tego protokołu z innymi technikami zapewni dalsze możliwości zastosowania różnych metod manipulacji. Po pierwsze, włączenie do plazmidowego DNA promotora specyficznego dla danej komórki umożliwi transfekcję specyficzną dla typu komórek, takich jak neurony, komórki glejowe i astrocyty. Po drugie, ponieważ transfekcja jest przejściowa, nie jest ona odpowiednia dla naukowców chcących analizować funkcję genu w późniejszym etapie życia. Dlatego połączenie z transpozazą w celu zintegrowania plazmidowego DNA z genomem przekształci ją w transfekcję stabilną ⁸. Następnie zastosowanie systemu tet-on lub tet-off umożliwi manipulowanie czasem lub specyficzną dla typu komórek ekspresją genów w komórkach nerwowych ⁸. Alternatywnie protokół ten można połączyć z indukowanymi tamoksyfenem rekombinazami Cre-ER(T) ⁹ oraz myszami reporterowymi ¹⁰.

Szeroka dostępność tkanek drastycznie zmieni projekty eksperymentalne stosowane w neuronauce.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
goły drut wolframowy o średnicy 125 μm	A-M Systems	797600
goły drut platynowy o średnicy 125 μm	A-M Systems	767000
elektrody w formie pręcików	Nepa gene	CUY610P4-1
szklana rurka kapilarna	Stoelting Co.	50611
mikromanipulator	KD Scientific	KDS310
nożyczki	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5865
generator impulsów	A-M Systems	Model 2100
klips autoklawowalny 9 mm	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-9260
piny pozłacane	World Precision Instruments, Inc.	5482
przeciwciało RORc	Perseus Proteomics	H3925