Mysi model bakteryjnego zapalenia wnętrza gałki ocznej: metoda generowania bakteryjnego zapalenia wnętrza gałki ocznej poprzez doszklistkowe wstrzyknięcie zawiesiny bakteryjnej do oka myszy

Abstract

Źródło: Mursalin, M. H. et al., Iniekcja doszklistkowa i kwantyfikacja parametrów infekcji w mysim modelu bakteryjnego zapalenia wnętrza gałki ocznej. J. Vis. Exp. (2021).

Ten film opisuje metodę generowania modelu myszy, który naśladuje bakteryjne zapalenie wnętrza gałki ocznej - infekcję wewnątrzgałkową wynikającą z inwazji bakterii do jamy ciała szklistego oka - poprzez doszklistkowe wstrzyknięcie zawiesiny bakteryjnej do oka. Ten mysi model pomaga badać mechanizm choroby i oceniać terapie dla niej.

Protocol

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Sterylne igły szklane

1. Włącz ściągacz do pipet igłowych.
2. Wyreguluj pokrętło grzałki, aż na wyświetlaczu pojawi się 12.6.
3. Otwórz drzwi i ręcznie przeprowadź rurkę kapilarną o pojemności 5 μl przez górny zacisk i żarnik grzałki, aż połowa rurki wysunie się poniżej żarnika (Rysunek 1A).
4. Upewnij się, że rurka kapilarna znajduje się w rowku "V" w górnym zacisku. Dokręcić górny clamp.
5. Gdy dolny zacisk otwarty, ręcznie wyreguluj suwak pionowy w górę, aż dolny clamp osiągnie górną granicę. Upewnij się, że rurka znajduje się w rowku "V" w dolnym zacisku. Dokręcić dolny zacisk.
6. Zamknij drzwi i upewnij się, że świeci się kontrolka "Gotowy". Naciśnij przycisk Start, aby zainicjować sekwencję grzałki i ciągnięcia (Rysunek 1B).
7. Upewnij się, że grzałka wyłącza się automatycznie po tym, jak ciepło i grawitacja rozerwą rurkę kapilarną (Rysunek 1C), a suwak przesunie się w dół.
8. Otwórz drzwi. Trzymając górną część rurki kapilarnej, odkręć górny zacisk. Wyjmij górną rurkę kapilarną i odłóż ją na bok.
9. Przytrzymaj rurkę kapilarną w dolnym suwaku i odkręć dolny zacisk. Wyjmij dolną rurkę kapilarną i odłóż ją na bok.
10. Użyj ukosowarki mikroelektrodowej z płytą szlifierską ze ścierniwa z tlenku glinu 0,05 μm, aby ukosować ciągniętą rurkę kapilarną w celu wytworzenia igieł iniekcyjnych.
11. Odpipetować odpowiednią ilość wody na płytę szlifierską, aby pokryła powierzchnię (Rysunek 1D).
12. Włącz ukosowarkę tak, aby zaczęła się obracać z prędkością 60 obr./min. Umieść wyciągniętą rurkę kapilarną w pipecie clamp w rowku "V". Dokręć zacisk i wyreguluj kąt zacisku pipety na 30°.
13. Wyreguluj końcówkę spiczastej krawędzi rurki kapilarnej w odległości około dwóch trzecich od środka obrotu płyty szlifierskiej.
14. Opuść zaciśniętą rurkę kapilarną, regulując zgrubne pokrętło sterujące w górnej części manipulatora. Kontynuuj opuszczanie rurki kapilarnej, aż końcówka rurki kapilarnej wysunie się poniżej powierzchni wody i zetknie się z powierzchnią ścierną płyty szlifierskiej.
15. Monitoruj postęp ukosowania za pomocą mikroskopu dołączonego do ukosowarki. Po 5 minutach wyreguluj precyzyjną kontrolę, aby podnieść szklaną igłę z płyty mielącej.
16. Wyjmij szklaną igłę i umieść ją pod 10-krotnym powiększeniem, aby sprawdzić końcówkę rurki kapilarnej (Rysunek 1E,F).
17. Aby upewnić się, że nie ma zatorów, włóż szklaną igłę do uchwytu na pipety na strzykawce i wepchnij powietrze do probówki o pojemności 1 ml zawierającej 99% etanol. Jeśli na końcu igły tworzą się pęcherzyki powietrza, oznacza to, że igła nie ma zatorów i może być używana do mikroiniekcji. Proces ten zapewnia również sterylność szklanych igieł.
18. Jedna rurka kapilarna może pomieścić do 5 μl płynu. Oznacz rurkę kapilarną na 10 sekcji, aby obliczyć odległości na igle do oznaczenia objętości 0,5 μl. Zaznacz wagę z tą odległością, która mieści 0,5 μl do przyszłego przygotowania. W przypadku igły o pojemności 5 μl odległości od siebie wynoszące 0,7 mm odpowiadają 0,5 μl (rysunek 1G).

2. Wstrzyknięcie doszklistkowe myszy

1. Wykonaj wszystkie procedury opisane w tej sekcji w warunkach poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2.
2. Przygotuj miejsce zabiegu, umieszczając podkładki medyczne na stole operacyjnym.
3. Włącz mikrowtryskiwacz i otwórz zawór gazu na zbiorniku sprężonego powietrza podłączonym do mikrowtryskiwacza. Wyreguluj regulator zbiornika, aż dopływ gazu wyniesie około 60 psi.
4. Na mikrowtryskiwaczu naciskaj Mode, aż na ekranie pojawi się Balance. Naciśnij przycisk Balance i umieść mysz komputerową na stole operacyjnym. Podłącz uchwyt na pipety ze stali nierdzewnej do rurki podłączonej do "Napełniania/Wyprowadzenia" wtryskiwacza. Ta rurka jest zawsze podłączona do wtryskiwacza.
5. Włóż igłę kapilarną do drugiego końca uchwytu pipety, dokręcając mocno łącznik uchwytu pipety wokół igły.
6. Włącz mikroskop okulistyczny i włącz jego światło o natężeniu 50%. Ustaw mikroskop nad miejscem zabiegu na stole operacyjnym i ustaw mikroskop na żądaną ostrość.
7. Przed rozpoczęciem zabiegu upewnij się, że mysz jest odpowiednio znieczulona, testując odruch wycofania pedału. Pamiętaj, aby postępować zgodnie z zatwierdzonym przez IACUC protokołem znieczulenia.
8. Umieść znieczuloną mysz na podkładkach medycznych z nosem skierowanym w prawo i opartym na lewym boku.
9. Spójrz na prawe oko myszy przez mikroskop okulistyczny i otwórz powieki, otwierając szczypce kleszczy o odwrotnym działaniu po obu stronach oka, aby odsłonić miejsce wstrzyknięcia (ryc. 2C).
10. Napełnij igłę kapilarną roztworem bakteryjnym Bacillus cereus (ATCC 14579) (rozcieńczenie 200 jtk/μl), klikając lewym przyciskiem myszy podkładkę pod mysz podłączoną do mikrowstrzykiwacza (rysunek 2D).
11. Zabezpiecz głowę zwierzęcia lewą ręką i umieść końcówkę igły na rąbku oka. Trzymając igłę w pozycji skośnej do góry i pod kątem 45°, nakłuć oko myszy, ale upewnić się, że podczas wstrzykiwania wkłada się tylko ostrą końcówkę igły (~0,5 mm).
12. Po wkłuciu końcówki igły przesuń lewą rękę od główki myszy do podkładki myszy i kliknij prawym przyciskiem myszy na podkładkę pod mysz, aby wstrzyknąć 0,5 μl rozcieńczenia B. cereus przygotowanego w bulionie Brain Heart Infusion (BHI). Aby zapobiec wyciekom, pozostaw końcówkę igły w uchu myszy na 2-3 sekundy przed wyjęciem (Rysunek 2E).
13. Zwolnij kleszcze i umieść mysz w klatce, która znajduje się na podkładce rozgrzewającej. Monitoruj te myszy, dopóki nie wyzdrowieją ze znieczulenia (ryc. 2F).
14. Gdy myszy wyjdą ze znieczulenia, umieść klatkę z powrotem na właściwym stojaku. Jeśli myszy zostaną poddane analizie funkcji siatkówki za pomocą elektroretinografii, klatki powinny zostać przeniesione z powrotem do ciemnego pomieszczenia w celu prawidłowej adaptacji do ciemności.

Results

Rysunek 1: Wykonywanie igieł szklanych ze skosem. Szklane igły wykonano z jednorazowych pipet mikrokapilarnych za pomocą ściągacza do igieł/pipet i ukosowania mikropipet. (A) Zaciśnięta szklana rurka kapilarna w ściągaczu do igieł/pipet. (B,C) Tworzenie szklanych igieł przy użyciu żądanego napięcia. (D) Ukosowanie szklanych mikropipet. (E,F<...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mikrowstrzykiwacz komórkowy	Instrument MicroData, Inc.	Pył zawieszony PM2000	nie
Pipety mikrokapilarne 5 mikrolitrów	Kimble	71900-5	nie
Ukosowarka do mikropipet	Instrument Sutter Co.	BV-10	nie
Mikroskop OPMI Lumera	Zeiss		nie
Kleszcze o odwróconym działaniu	Kastena	Zobacz materiał K5-8228	nie