Perfuzja płuc ex vivo: technika badań płuc na modelu królika

Streszczenie

Źródło: Pacheco-Baltazar, A., et al., Izolowany system perfuzji płuc w modelu królika. J. Vis. Exp. (2021).

Ten film pokazuje technikę ex vivo izolowanej perfuzji płuc. Jest to narzędzie do badań płuc, które pomoże w badaniach nad różnymi mechanizmami fizjologicznymi i patologicznymi związanymi z procedurami przeszczepiania płuc.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Kaniulacja:

1. Umieść świeżo wyizolowane płuca królika wraz z sercem na sterylnej gazie na szalce Petriego.
2. Aby zapobiec niedodmie, należy przewietrzyć płuca za pomocą wentylacji nadciśnieniowej z dodatnim ciśnieniem wydechowym (PEEP) ustawionym na 2_cmH2O.
3. Usuń komory, odcinając je od serca na poziomie rowka przedsionkowo-komorowego.
4. Po otwarciu dwóch komór wprowadzić kaniulę tętnicy płucnej OD 4,6 mm dla królika z koszem przez tętnicę płucną i wprowadzić kaniulę lewego przedsionka OD 5,9 mm dla królika z koszem przez zastawkę mitralną do lewego przedsionka.
5. Użyj jedwabnego szwu 4-0 w tętnicy płucnej i lewym przedsionku, aby zamocować kaniule. Uwzględnij otaczające tkanki w ligaturach tętnicy płucnej i lewym przedsionku, aby uniknąć rozdęcia tych struktur.
6. Wstrzyknąć 250 ml izotonicznego roztworu soli fizjologicznej przez kaniule tętnicze, aby wypłukać pozostałą krew z łożyska naczyniowego.

2. Technika perfuzji:

1. Instalacji:
   1. Ostrożnie umieść izolowane płuca w komorze płuc.
   2. Przymocuj tchawicę do przetwornika na pokrywie komory.
   3. Podłącz naczynia kaniulowane do systemu perfuzyjnego.
   4. Zamknij komorę i zabezpiecz ją blokadą obrotową.
      nuta: Recyrkulacyjny obwód perfuzyjny składa się z otwartego zbiornika żylnego, pompy perystaltycznej, wymiennika ciepła i pułapki bąbelkowej.
   5. W tym momencie załóż pokrywę komory i przekręć kurek, aby przełączyć się z wentylacji dodatniej na podciśnieniową. Aby sprawdzić wentylację podciśnieniową płuc i hermetyczne zamknięcie komory, należy sprawdzić ruch oddechowy płuc i ciśnienie w komorze na manometrze.
   6. Perfuzjować płuca 200 ml sztucznego, bezkrwistego perfuzatu (bufor wodorowęglanowy Krebsa-Ringera zawierający 2,5% albuminy bydlęcej).
   7. Rozpocznij przepływ perfuzatu od 3 ml/min/kg, a następnie powoli zwiększaj przepływ przez 5 minut do 5 ml/min/kg. Osiągnij przepływ 8 ml/min/kg w ciągu następnych 5 minut, a następnie po kolejnych 5 minutach osiągnij maksymalny strumień 10 ml/min/kg. Uważaj, aby powietrze nie dostało się do obwodu.
      nuta: Utrzymać pH i temperaturę perfuzatu w zakresach fizjologicznych (pH 7,4-7,5; temperatura, 37 °C-38 °C). Aby dostosować pH, dodaj NaHCO₃ (1N) lub zwiększ przepływ dwutlenku węgla. Alternatywnie użyj HCl (0,1N) do zakwaszenia.
2. Parametry:
   1. Sprawdź, czy wstępnie określone parametry perfuzji i wentylacji są ustawione zgodnie z wymaganiami.
   2. Przewietrzyć płuca wilgotnym powietrzem z częstotliwością 30 uderzeń na minutę, objętością oddechową 10 ml/kg i ciśnieniem końcowo-wydechowym (Pe) 2 cmH₂O.
      nuta: Ciśnienie tętnicze płuc (0-20 mmHg) odpowiada wysokości poziomu płynu w dotleniaczu lub zbiorniku w centymetrach powyżej pnia płucnego, natomiast ciśnienie w żyle płucnej odpowiada wysokości komory wyrównującej ciśnienie nad lewym przedsionkiem. Obie wartości można modyfikować. Należy pamiętać, że ciśnienie w lewym przedsionku również wynosi 0-20 mmHg.
3. Osiągnięcie warunków strefy 3:
   1. Użyj dwóch cewników połączonych z bocznymi portami kaniul zamocowanych w tętnicy płucnej, lewym przedsionku i przetwornikach ciśnienia, aby zmierzyć ciśnienie tętnicze (Pa) i żylne (Pv).
   2. Ustaw ciśnienie podstawowe na poziomie wnęki płuca (odniesienie zerowe).
   3. Przeprowadzaj eksperymenty w warunkach wentylacji strefy 3. Aby to osiągnąć, należy odczekać 10-15 minut, aby uzyskać równowagę charakteryzującą się stanem izograwimetrycznym.
   4. Upewnij się, że ciśnienie żylne jest wyższe niż ciśnienie w pęcherzykach płucnych (Palv), a ciśnienie tętnicze pozostaje wyższe niż oba (Pa > Pv > Palv), aby wystąpiły warunki strefy 3.
   5. Upewnij się, że masa płuc pozostaje stała, a ciśnienie w tętnicy i lewym przedsionku jest stabilne, aby osiągnąć warunki strefy 3, aby otworzyć maksymalną liczbę naczyń płucnych i utrzymać zawartość łożyska mikronaczyniowego podczas eksperymentu.
      nuta: Pomiar Kfc jako wskaźnika obrzęku płuc nie różni się między ręcznym a automatycznym systemem perfuzyjnym.
4. Elektroniczne sterowanie i przetwarzanie sygnałów: Upewnij się, że przepływ oddechowy, zmiany masy, ciśnienie mikronaczyniowe, objętość oddechowa, opór naczyniowy, między innymi, są rejestrowane w wielu centralnych jednostkach elektronicznych, które integrują sygnały pochodzące z przetworników i wyświetlają je w systemie oceny.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Rurka Tygon E-Lab 2-Stop, średnica wewnętrzna 3.17 mm, 12 sztuk w opakowaniu,/Biały	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-1864
Adapter do wentylacji nadciśnieniowej w IPL-4	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-4312
Adapter do wentylacji nadciśnieniowej w IPL-4	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-4312
Alternatywne bezciśnieniowe zasilanie gazem dla IPL-4: Do zasilania tchawicy mieszanką gazów inną niż powietrze w pomieszczeniu podczas wentylacji ujemnej	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	Nr kat. 73-4309
Jednostka podstawowa dla królika do płodu świni izolowane perfundowane płuco	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	Nr kat. 73-4138
Surowica bydlęca A2: D41albumina liofilizowana w proszku	Sigma	Numer katalogowy: 3912	500 gramów
Chlorek wapnia, CaCl2·2H2O.	J.T. Piekarz	Numer katalogowy: 10035-04-8
Fiolki kriogeniczne	Corning	430659	2 ml
D-glukoza, C6H12O6.	Sigma	Zobacz materiał G5767
Przetwornik różnicowy niskiego ciśnienia DLP2.5, zakres +- 2,5 cmH2O, złącze HSE	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-3882
Przetwornik różnicy ciśnień MPX, zakres +- 100 cmH2O, Złącze HSE	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	Nr kat. 73-0064
Rurki Eppendorfa
Absolutna klasa HPLC etanolu	Kaledon
Rurki Falcon			14 ml
Pompa perystaltyczna Harvard P-230 (w komplecie ze skrzynką sterowniczą i napędem silnikowym P-230)	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	Nr kat. 70-7001
Podgrzewany pneumatyczny liniowy zakres przepływu od 0 do 10 l/min	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	Numer katalogowy: 59-9349
Sterownik grzałki do pojedynczego pneumotachometru 230 VAC, 50 Hz	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	59-9703
heparyna	Piza		Interfejs użytkownika 5000
Kolumna HPLC (C18 100A 5U)	Firma Alltech	98121213	150 mm x 4,6 mm
Hydrofilowy filtr strzykawkowy	Młyny Millex	SLLGR04NL	Grubość 4 mm
System rdzeniowy IPL-4 do izolowanego płuca od królika do płodu świni, 230	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	Nr kat. 73-4296
System rdzeniowy IPL-4 do izolowanego płuca od królika do płodu świni, 230 V	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	Nr kat. 73-4296
Szklany zbiornik z płaszczem na roztwór buforowy, z frytą i rurką, 6.0 L	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	Nr kat. 73-0322
Pompa termostatyczna Lauda, typ E-103, 230 V/50 Hz, pojemność wanny 3 l, zakres temperatur od 20 do 150°C	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	Nr kat. 73-0125
Lewa kaniula przedsionka dla królika z koszem, średnica zewnętrzna 5,9 mm	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	Nr kat. 73-4162
Przetwornik ciśnienia krwi niskiego zakresu P75 do modułu PLUGSYS	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-0020
Siarczan magnezu siedmiowodny, MgSO4·7H2O	J.T. Piekarz	Numer katalogowy: 10034-99-8
Probówka do mikrowirówek	Corning	430909
Opcja sterowania wentylacją podciśnieniową z regulatorem ciśnienia dla IPL-4	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	Nr kat. 73-4298
Króliki Nowej Zelandii
PISABENTAL (Pentobarbital sodowy)	Piza	Nr kat. Q-7833-215
Obudowa PLUGSYS, typ 603* 7	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	Nr kat. 73-0045
Moduł licznika czasu PLUGSYS TCM	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-1750
Moduł wzmacniacza przetwornika PLUGSYS (TAM-A)	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	Nr kat. 73-0065
Moduł wzmacniacza przetwornika PLUGSYS (TAM-D)	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-1793
PLUGSYS VCM-4R Moduł sterujący wentylacją z regulatorem ciśnienia	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-1755 Rozdział 1755
Chlorek potasu, KCl.	J.T. Piekarz	3040-01
Diwodorofosforan potasu, KH2PO4	J.T. Piekarz	7778-77-0
Kaniula tętnicy płucnej dla królika z koszem, OD 4,6 mm	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	Nr kat. 73-4161
Kontroler serwomechanizmu do perfuzji (SCP	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	Nr kat. 73-2806
Probówka do mikrowirówek z zatrzaskiem	Costar	Numer katalogowy: 3620	1,7 ml
Wodorowęglan sodu, NaHCO3	Sigma	Zobacz materiał S6014
Chlorek sodu, NaCl.	Sigma	Numer katalogowy S9888
Rękawice chirurgiczne nr 7 1/2
Rękawice chirurgiczne nr 8
Rurki Taygon	Technologia Masterflex
Kaniula tchawicy dla królika, OD 5,0 mm	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	Nr kat. 73-4163

TGL TGL LAT powiedział: