Izolowanie komórek IPE i RPE: technika pozyskiwania komórek nabłonka pigmentowego oka z oka królika

Streszczenie

Źródło: Bascuas, T., et al. Izolacja, hodowla i inżynieria genetyczna pierwotnych komórek nabłonka barwnikowego ssaków do niewirusowej terapii genowej. J. Vis. Exp. (2021).

W tym filmie pokazujemy procedurę pozyskiwania komórek nabłonka pigmentowego oka od modelu królika. Komórki są pomocne w opracowywaniu strategii terapeutycznych w chorobach zwyrodnieniowych siatkówki.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

Nowozelandzkie białe króliki zostały poddane eutanazji przez przedawkowanie pentobarbitalu (150 mg/kg) rozcieńczonego w 0,9% NaCl wstrzykniętym dootrzewnowo, a oczy zostały wyłuszczone natychmiast po złożeniu

ofiary.

1. Przed przygotowaniem

1. Przygotować kompletną pożywkę (DMEM/Ham's F12 uzupełniony 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 80 U/ml penicyliny / 80 μg/ml streptomycyny i 2,5 μg/ml amfoterycyny B). Podgrzej pożywkę, 1x PBS i 0,25% trypsyny (jeśli to konieczne) w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
2. Włóż sterylną serwetę do okapu, aby przygotować aseptyczne miejsce pracy. Wprowadź wszystkie potrzebne sterylne narzędzia i materiały do wnętrza okapu.
   nuta: Tylko wyłuszczenie oczu i oczyszczenie pozostałej tkanki mięśniowej i skóry to zabiegi przeprowadzane na zewnątrz kaptura, reszta kroków musi być wykonana wewnątrz kaptura.

2. Izolacja komórek PE królika

1. Użyj zakrzywionych nożyczek i kleszczy Colibri, aby wyłuszczyć oczy po eutanazji zwierzęcia. Oczyść pozostałą tkankę mięśniową i skórę z oczu za pomocą nożyczek i kleszczy (niesterylnych).
   nuta: Rozmiar nożyczek i kleszczy używanych do wyłuszczenia i czyszczenia oczu zależy od gatunku (np. w przypadku szczurów i myszy narzędzia będą mniejsze niż te używane u świń i bydła) (patrz ryc. 1).
   1. Zebrać oczy w probówce o pojemności 50 ml wypełnionej niesterylnym PBS i przenieść probówkę do okapu z przepływem laminarnym. Zdezynfekuj oczy, zanurzając je na 2 minuty w roztworze na bazie jodu, a następnie przenieś je na szalkę Petriego wypełnioną sterylnym PBS.
2. Otwarcie żarówki
   1. Połóż jedno oko na sterylnym kompresie z gazy i trzymaj je mocno blisko nerwu wzrokowego. Otwórz oko skalpelem #11 i nożyczkami około 2 mm pod rąbkiem. Usuń przedni odcinek (rogówkę, soczewkę i tęczówkę) i umieść go na szalce Petriego. Pozostaw bańkę z ciałem szklistym, aż komórki RPE zostaną odizolowane.
3. Izolacja komórek IPE
   1. Zdejmij soczewkę i za pomocą cienkich kleszczyków delikatnie wyciągnij tęczówkę zawierającą komórki IPE. Umieść tęczówkę na szalce Petriego, umyj sterylnym PBS i pozostaw w PBS, aż przygotuje się więcej tęczówki. Usuń ciało rzęskowe z tęczówki, przecinając skalpelem #10.
   2. Po przygotowaniu 2 tęczówek inkubować z 1 ml 0,25% trypsyny w temperaturze 37 °C przez 10 minut; w tym czasie można wyizolować komórki RPE (patrz krok 2.4). Usuń trypsynę i dodaj 1 ml kompletnej pożywki do tęczówki i odizoluj komórki, ostrożnie drapiąc płaską, polerowaną ogniowo pipetą Pasteura. Ostrożnie zawiesić komórki przez pipetowanie i przenieść zawiesinę komórek do probówki o pojemności 1,5 ml. Pobrać 10 μl zawiesiny komórek i rozcieńczyć w stosunku 1:3 błękitem trypanowym, aby policzyć komórki w komorze Neubauera.
   3. Jeśli nie zostanie natychmiast transfekowany, wysiewaj 200 000 komórek/basenik na 24-dołkowej płytce (100 000 komórek/cm²) w 1 ml kompletnego podłoża (10% FBS) (do wysiewu patrz Tabela 1). Umieścić płytkę w inkubatorze i hodować ją w temperaturze 37 °C, 5% CO2,
      nuta: Może być konieczne połączenie kilku oczu razem, aby mieć wystarczającą liczbę komórek do wysiewu.
4. Izolacja komórek RPE
   1. Usuń ciało szkliste i siatkówkę z tylnego segmentu za pomocą cienkich kleszczy. Unikaj uszkodzenia nabłonka barwnikowego siatkówki.
   2. Umieść sterylną gazę na płytce 12-dołkowej i umieść bańkę na gazie.
   3. Umyć PBS. Dodać 50 μl 0,25% trypsyny na oko i inkubować przez 10 minut w temperaturze 37 °C. Usunąć trypsynę i dodać 150 μl kompletnej pożywki na kulę i delikatnie zeskrobać komórki RPE zakrzywioną, polerowaną ogniowo pipetą Pasteura; Użyj cienkich kleszczy, aby unieruchomić tkankę. Zebrać zawiesinę komórek i umieścić ją w probówce o pojemności 1,5 ml. Pobrać 10 μl zawiesiny komórek; rozcieńczyć w stosunku 1:4 błękitem trypanowym, aby policzyć komórki w komorze Neubauera.
   4. Odwirować komórki 10 minut przy 120 x g.
   5. Jeśli nie zostanie natychmiast transfekowany, wysiewaj 200 000 komórek/basenik na 24-dołkowej płytce (100 000 komórek/cm²) w 1 ml kompletnego podłoża (10% FBS) (do wysiewu patrz Tabela 1). Umieścić płytkę w inkubatorze i hodować ją w temperaturze 37 °C, 5% CO2,
      nuta: Może być konieczne połączenie kilku oczu razem, aby mieć wystarczającą liczbę komórek do wysiewu.

Wyniki

gatunek	Leczenie trypsyną	Liczba ogniw IPE	Liczba ogniw RPE	Talerz do wysiewu (100 000 komórek/cm2)
królik	tak	~350 000	~2 500 000	Płytki 24-dołkowe

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Płytki 12-dołkowe	Corning	353043
Płytki 24-dołkowe	Corning	353047
Betadine (Betadyna)	Mundipharma powiedział:
Mikrokleszczyki Bonn płaskie
Kleszcze Colibri (sterylne)
DMEM/Szynka F12	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał D8062
Serweta (sterylna)	Opieka zdrowotna Mölnlycke	Numer katalogowy: 800530
FBS (Sieć Usługowa	Brunschwig (powiat Brunschwig	Zobacz materiał P40-37500
Kleszcze (różne rozmiary) (sterylne)
Kompres z gazy	PROMEDICAL AG	Numer katalogowy: 25403
NaCl (0,9%)	Laboratorium Dr. Bichsel AG	1000090
Komora Neubauera	Marienfeld-superior	Numer katalogowy: 640010
Pipeta Pasteura (fire-polish)	Witeg	4100150
PBS 1X	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał D8537
Penicylina/Streptomycyna	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał P0781-100
Pentobarbital (Thiopental Inresa)	Ospedalia AG	31408025
szalka Petriego	ThermoFisher Naukowy	150288
Szkarpel nr 10	Swann-Morton	Okręg wyborczy 501
Szkarpel nr 11	Swann-Morton	Okręg wyborczy 503
Ostra-ostra końcówka zakrzywione nożyczki Extra Fine Bonn (sterylne)
Ostra-ostra końcówka proste Nożyczki Extra Fine Bonn (sterylne)
Trypsyna 0,25%	ThermoFisher Naukowy	25050014
Nożyczki sprężynowe Vannas zakrzywione (sterylne)

) TGL TGL TGL