Izolacja komórek IPE i RPE: technika uzyskiwania pigmentowanych komórek nabłonkowych z izolowanego oka świni

Streszczenie

Źródło: Bascuas T. et al., Izolacja, hodowla i inżynieria genetyczna pierwotnych komórek nabłonka barwnikowego ssaków do niewirusowej terapii genowej. J. Vis. Exp. (2021).

W tym filmie opisujemy technikę izolowania komórek nabłonka tęczówki i barwnika siatkówki z oczu świń w celu uzyskania ich pierwotnych kultur do badań in vivo i ex vivo. Te komórki pigmentowe mogą być genetycznie modyfikowane w celu zbadania metod regeneracyjnych w leczeniu chorób oczu.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny komitet ds. opieki nad zwierzętami oraz komisję weterynaryjną JoVE.

1. Przed przygotowaniem

1. Przygotować kompletną pożywkę (DMEM/Ham's F12 uzupełniony 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 80 U/ml penicyliny / 80 μg/ml streptomycyny i 2,5 μg/ml amfoterycyny B). Podgrzej pożywkę, 1x PBS i 0,25% trypsyny (jeśli to konieczne) w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
2. Włóż sterylną serwetę do okapu, aby przygotować aseptyczne miejsce pracy. Wprowadź wszystkie potrzebne sterylne narzędzia i materiały do wnętrza okapu.
   UWAGA: Tylko wyłuszczenie oczu i oczyszczenie pozostałej tkanki mięśniowej i skóry to zabiegi wykonywane na zewnątrz okapu, pozostałe czynności należy wykonać wewnątrz kaptura.
3. Oczy świń pozyskiwano z lokalnej rzeźni w ciągu 6 godzin od złożenia ofiary i transportowano do laboratorium na lodzie

2. Izolacja komórek PE świni

1. Użyj zakrzywionych nożyczek i kleszczy Colibri, aby wyłuszczyć oczy po eutanazji zwierzęcia. Oczyść pozostałą tkankę mięśniową i skórę z oczu za pomocą nożyczek i kleszczy (niesterylnych).
   nuta: Rozmiar nożyczek i kleszczy używanych do wyłuszczenia i czyszczenia oczu zależy od gatunku (np. w przypadku szczurów i myszy narzędzia będą mniejsze niż te używane u świń i bydła) (patrz ryc. 1).
   1. Zebrać oczy w probówce o pojemności 50 ml wypełnionej niesterylnym PBS i przenieść probówkę do okapu z przepływem laminarnym. Zdezynfekuj oczy, zanurzając je na 2 minuty w roztworze na bazie jodu, a następnie przenieś je na szalkę Petriego wypełnioną sterylnym PBS.
   2. Po przeniesieniu oczu na sterylną szalkę Petriego, przytrzymaj je mocno blisko nerwu wzrokowego za pomocą Colibri lub spiczastych kleszczy. Przebić otwór w pobliżu granicy tęczówki (między pars plana a ora serrata) za pomocą igły 18 G. Włóż małe nożyczki do otworu i przetnij wokół tęczówki. Usuń przedni odcinek (rogówkę, soczewkę i tęczówkę) i umieść go na szalce Petriego. Pozostaw bańkę z ciałem szklistym, aż komórki RPE zostaną odizolowane.

3. Izolacja komórek IPE

1. Usuń ciało rzęskowe z tęczówki, przecinając skalpelem #10. Po przygotowaniu 2 tęczówek dodaj 1 ml kompletnej pożywki i wyizoluj komórki, ostrożnie drapiąc płaską, wypolerowaną ogniowo pipetą Pasteura. Przenieść zawiesinę komórek do probówki o pojemności 1,5 ml. Pobrać 10 μl zawiesiny komórek i rozcieńczyć w stosunku 1:4 błękitem trypanowym, aby policzyć komórki w komorze Neubauera.
2. Jeśli nie zostanie natychmiast transfekowany, wysiewaj 200 000 komórek/basenik na 24-dołkowej płytce (100 000 komórek/cm²) w 1 ml kompletnego podłoża (10% FBS) (do wysiewu patrz Tabela 1). Umieścić płytkę w inkubatorze i hodować ją w temperaturze 37 °C, 5% CO₂,
   nuta: Może być konieczne połączenie kilku oczu razem, aby mieć wystarczającą liczbę komórek do wysiewu.

4. Izolacja komórek RPE

1. Wykonaj krok 1.1.1. Umieść bańkę na szalce Petriego i umyj PBS. Napełnij bańkę 1 ml kompletnego podłoża.
2. Za pomocą zakrzywionej, polerowanej ogniowo pipety Pasteura ostrożnie usuń komórki RPE. Upewnij się, że zeskrobywasz od dołu do góry, aby uniknąć ześlizgiwania się kompleksu błonowego naczyniówki-Brucha. Zebrać zawiesinę komórek w bańce za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl i przenieść do probówki o pojemności 1,5 ml w celu ponownego zamieszania. Pobrać 10 μl zawiesiny komórek i rozcieńczyć w stosunku 1:8 błękitem trypanowym, aby policzyć komórki w komorze Neubauera.
3. Komórki nasienne zgodnie z opisem w kroku 3.2.

Wyniki

gatunek	Leczenie trypsyną	Liczba ogniw IPE	Liczba ogniw RPE	Talerz do wysiewu (100 000 komórek/cm2)
świnia	Nie	~1 000 000	~3 000 000	Płytki 24-dołkowe

<...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Płytki 12-dołkowe	Corning	353043
Płytki 24-dołkowe	Corning	353047
Betadine (Betadyna)	Mundipharma powiedział:
Mikrokleszczyki Bonn płaskie
Kleszcze Colibri (sterylne)
DMEM/Szynka F12	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał D8062
FBS (Sieć Usługowa	Brunschwig (powiat Brunschwig	Zobacz materiał P40-37500
Kleszcze (różne rozmiary) (sterylne)
NaCl (0,9%)	Laboratorium Dr. Bichsel AG	1000090
Igła (18G)	Terumo (Ziemia)	TER-NN1838R
Komora Neubauera	Marienfeld-superior	Numer katalogowy: 640010
Pipeta Pasteura (fire-polish)	Witeg	4100150
PBS 1X	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał D8537
Penicylina/Streptomycyna	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał P0781-100
szalka Petriego	ThermoFisher Naukowy	150288
Szkarpel nr 10	Swann-Morton	Okręg wyborczy 501
Szkarpel nr 11	Swann-Morton	Okręg wyborczy 503
Ostra-ostra końcówka zakrzywione nożyczki Extra Fine Bonn (sterylne)
Ostra-ostra końcówka proste Nożyczki Extra Fine Bonn (sterylne)
Cytometr obrazowy Tali	ThermoFisher Naukowy	Zobacz materiał T10796
Trypsyna 0,25%	ThermoFisher Naukowy	25050014
Trypsyna 5%/EDTA 2%	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał T4174
Nożyczki sprężynowe Vannas zakrzywione (sterylne)

) TGL TGL TGL TGL