Model rogówki ex vivo świńskiego bakteryjnego zapalenia rogówki: technika ustalania infekcji bakteryjnej w komórkach nabłonka rogówki

Streszczenie

Źródło: Okurowska, K., et al. Establishing a Porcine Ex Vivo Cornea Model for Study Drug Treatments against Bacterial Keratitis. J. Vis. Exp (2020).

Ten film opisuje protokół tworzenia modelu ex vivo dla bakteryjnego zapalenia rogówki za pomocą guzika korneo-twardówkowego wypreparowanego z oka świni. Zaszczepione bakterie przechodzą przez nacięcia nabłonka rogówki, aby zaatakować leżące poniżej zrąb i wywołać infekcję w tkankach rogówki, która naśladuje infekcję in vivo.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny komitet ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE

1. Przygotowanie inokulum

1. Wlej 10 ml bulionu LB do stożkowej kolby o pojemności 50 ml z korkiem piankowym
.
2. Przenieść kolonię szczepu PAO1 lub szczepu PA14 P. aeruginosa ze świeżej płytki agarowej i inkubować w temperaturze 37 °C przez 3-4 godziny, aż bakterie znajdą się w połowie fazy logarytmicznej.
3. Przenieść kulturę bakterii do probówki o pojemności 50 ml i odwirować przy 3 000 x g przez 5 minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w PBS.
4. Powtórz krok 1.3 jeszcze dwa razy, aby umyć komórki. Ponownie zawiesić osad komórkowy w PBS i dostosować gęstość optyczną przy 600 nm do około 0,6, używając sterylnego PBS jako ślepej próby.

2. Zakażenie guzika oponowo-twardówkowego

1. Usunąć pożywkę z szalki Petriego i dwukrotnie przepłukać rogówkę 1 ml sterylnego PBS.
2. Delikatnie ściśnij kleszcze, trzymając rogówkę pomiędzy nimi. Użyj skalpela 10A, aby wykonać cztery cięcia - dwa pionowe, dwa poziome - w środkowej części guzika korneotwardówki przez warstwę nabłonka do leżącego poniżej zrębu.
3. Umieść sterylną szklaną formę na 6-dołkowej płytce szeroką częścią do góry i umieść rogówkę na środku szklanej formy, stroną z nabłonkiem skierowaną w dół. Wykonaj nacięcie dokładnie na środku dolnej części szklanej formy.
4. ETAP KRYTYCZNY: Wlej 1 ml 1% (w/v) agaru o niskiej temperaturze topnienia rozpuszczonego w DMEM, aby całkowicie wypełnić szklaną formę rogówką.
5. Poczekaj, aż agar stężeje, a następnie odwróć szklaną formę tak, aby nabłonek rogówki był skierowany do góry.
6. Odpipetować 15 μl kultury bakteryjnej o średnicy zewnętrznej_{600 nm} = 0,6 (dla P. aeruginosa odpowiada to około 1 x 10⁷ jednostek tworzących kolonie (CFU) w 15 μl) bezpośrednio do obszaru cięcia, a następnie dodać 85 μl PBS do góry, aby nabłonek rogówki był wilgotny. Rozcieńczyć pozostałą kulturę bakteryjną i płytkę na agarze w celu policzenia jednostek tworzących kolonie dla inokulum.
7. Dodaj 1 ml DMEM bez antybiotyków na dno każdej studzienki za pomocą szklanej formy. Inkubować 6-dołkową płytkę z zakażonymi guzikami twardówki w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ przez okres do 24 godzin.
8. Zakładaj niezainfekowaną rogówkę kontrolną przy każdym eksperymencie. Aby skonfigurować niezakażoną kontrolę, zastąp 15 μl kultury bakteryjnej w kroku 2.6 sterylnym PBS.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Probówka Falcon 50 ml	Sls	Numer katalogowy: 352070
Amfoterycyna B	Sigma	Nr kat. A2942
Płytka 12-dołkowa Cellstar	Greiner Bio-One	Numer katalogowy: 665180
Dekstran	Sigma	31425-100mg-F
Dystelacja	Fisher Naukowy	12899357
DMEM + glutamax	Sls	D0819
Inkubator z podwójnym piekarnikiem	Sls	OVe1020	Piec sterylizujący
Naskórkowy czynnik wzrostu	Sls	E5036-200UG
SZYNKA F12	Sigma	Nr kat. N4888
Surowica cielęca płodu	Labtech Międzynarodowy	CA-115/500
Kleszcze	Fisher Naukowy	15307805
Heracell VIOS 160i	Thermo Scientific	15373212	Inkubator do hodowli tkankowych
Insulina rekombinowana ludzka	Sls	91077C-1G
Agar LB	Sigma	L2897
Wielotron	Materiały informacyjne	Nie dotyczy	Inkubator bakteryjny
Pbs	Sls	Zobacz materiał P4417
Penicylina-Streptomycyna	Sls	Zobacz materiał P0781
szalka Petriego	Fisher Naukowy	12664785
szalka Petriego 35x10mm CytoOne	Starlab (Laboratorium Starlab)	Zobacz materiał CC7672-3340
Jod powidonu	Apteka Weldricks	2122828
Bezpieczny 2020	Fisher Naukowy	1284804	Komora bezpieczeństwa mikrobiologicznego klasy II
Ostrze skalpela numer 15	Fisher Naukowy	O305
Skalpel Swann Morton	Fisher Naukowy	11849002

powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: