Model biofilmu płuc świni ex vivo: technika opracowywania modelu płuc do badania biofilmów bakteryjnych w tkance oskrzelików świni

Streszczenie

Źródło: Harrington, N.E. et al., Testowanie skuteczności antybiotyków w modelu ex vivo biofilmów Pseudomonas aeruginosa i Staphylococcus aureus w płucach mukowiscydozy. J. Vis. Exp. (2021).

Ten film opisuje protokół tworzenia ex vivo modelu płuc świni z biofilmu bakteryjnego na zakażonej tkance oskrzelików. Biofilmy to agregaty bakteryjne osadzone w matrycy przylegającej do powierzchni. Model ten służy do badania wrażliwości bakterii na antybiotyki na różnych etapach tworzenia biofilmu.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Preparacja i zakażenie tkanki płuc świni ex vivo (EVPL)

1. Przygotuj SCFM do użytku z tkanką EVPL, postępuj zgodnie z przepisem na 1 l zmodyfikowanego SCFM podanym w Tabeli 1.
2. Przed preparacją należy przygotować płytkę agarową z wymaganym szczepem lub szczepami bakteryjnymi do infekcji przy użyciu dowolnego agaru, który jest standardem w laboratorium dla P. aeruginosa/S. aureus (np. bulion lizogeniczny + 1,2% agar
).
3. Oblicz, ile fragmentów tkanki oskrzelików świń jest potrzebnych do eksperymentu, w tym niezakażonych fragmentów tkanki kontrolnej. Pomnóż tę liczbę przez dwa, aby powtórzyć eksperyment w dwóch powtórzonych płucach, aby potwierdzić powtarzalność wyników.
4. Pomnóż całkowitą liczbę wymaganych fragmentów tkanek przez 0,5, aby określić objętość agarozy SCFM (ml) potrzebną do przygotowania wacików agarozowych, aby uzyskać wystarczającą ilość podłoża na 400 μl / kawałek tkanki plus zapasowy agar SCFM, aby uwzględnić wszelkie błędy pipetowania lub parowanie podczas przygotowania.
5. Dodać 0,12 g agarozy do każdych 15 ml SCFM wymaganych do uzyskania pożądanej całkowitej objętości SCFM z 0,8% wagowo-objętościowej agarozy.
6. Podgrzewać roztwór agarozy SCFM, aż agaroza całkowicie się rozpuści. Zalecana jest domowa kuchenka mikrofalowa o małej mocy. Wymagany czas zależy od mocy kuchenki mikrofalowej. Pozwól agarozie ostygnąć do około 50 °C (ciepła w dotyku, ale wygodna w trzymaniu). Nie dopuścić do dalszego ostygnięcia.
7. Za pomocą pipety dodać 400 μl agarozy SCFM do jednego dołka 24-dołkowej płytki na potrzebny kawałek tkanki.
8. Sterylizować 24-dołkową płytkę (płytki) zawierające agarozę SCFM w świetle ultrafioletowym przez 10 minut.
9. Przygotuj trzy powtórzone płukania dla każdego nienaruszonego płuca poddawanego sekcji, używając 20 ml sterylnego zmodyfikowanego podłoża Eagle (DMEM) firmy Dulbecco oraz 20 ml sterylnego Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 uzupełnionego 50 μg/ml ampicyliny.
10. Wykonać porcję 40 ml SCFM jako końcowe płukanie dla każdego nienaruszonego płuca poddawanego sekcji. Wszystkie prania można przechowywać przez noc w temperaturze 4 °C lub natychmiast zużyć.
11. Płuca należy pozyskać z wyznaczonego źródła tak szybko, jak to możliwe po uboju, upewniając się, że są one przechowywane w niskiej temperaturze, transportując je do laboratorium w domowej lodówce.
    nuta: Płuca znajdujące się bliżej dnia uboju wykazują mniej siniaków spowodowanych przechowywaniem, ale można również wykorzystać tkanki przechowywane w chłodni przez okres do 4 dni od uboju. Ponieważ lodówka musi zostać zabrana do sklepu mięsnego lub rzeźni, po każdym użyciu musi zostać odkażona zgodnie z lokalnymi wytycznymi laboratoryjnymi i przechowywana poza laboratorium mikrobiologicznym, gdy nie jest używana, aby zmniejszyć ryzyko zanieczyszczenia i naruszenia zabezpieczeń.
12. Pracując na wysterylizowanej powierzchni i pod płomieniem, umieść płuca na czystej plastikowej desce do krojenia pokrytej autoklawowaną folią aluminiową. Sprawdź, czy oskrzeliki pozostają nienaruszone. Jeśli doszło do jakiegokolwiek uszkodzenia w rzeźni lub podczas transportu, płuca nie nadają się do użytku.
13. Podgrzej szpachlówkę pod płomieniem i bardzo krótko przyłóż nóż do obszaru płuca otaczającego oskrzelik, aby wysterylizować powierzchnię tkanki.
14. Odetnij tkankę powierzchniową otaczającą oskrzelik za pomocą sterylnie zamontowanej żyletki. Wykonuj nacięcia równolegle do oskrzelików, aby zapobiec uszkodzeniom.
15. Po odsłonięciu oskrzelików wykonaj nacięcie przekroju poprzecznego przez oskrzelik w najwyższym widocznym punkcie, aby uwolnić oskrzelik.
16. Za pomocą sterylnych kleszczy lekko przytrzymaj wolny koniec oskrzelika i odetnij pozostałą niechcianą tkankę za pomocą sterylnie zamontowanej żyletki. Wykonaj ostatnie nacięcie w przekroju poprzecznym w poprzek oskrzelików, zanim widoczne będą jakiekolwiek rozgałęzienia, aby usunąć oskrzeliki z płuc.
17. Umieść oskrzelik w pierwszym płukaniu DMEM/RPMI 1640. Pozostawić skrzelik w płuczce i powtórzyć kroki od 1.12 do 1.15 w celu pobrania dodatkowych skrawków oskrzelików z tego samego płuca, zgodnie z wymaganiami w celu uzyskania wystarczającej ilości skrawków tkanki do planowanego doświadczenia.
18. Umieścić wszelkie dodatkowe skrawki oskrzelików z tego samego płuca w płucu do płukania (krok 1.17). Pozostaw w praniu na co najmniej 2 minuty.
19. Usunąć oskrzeliki z pierwszego płukania DMEM/RPMI 1640 i umieścić próbki na sterylnej szalce Petriego.
20. Trzymaj lekko każde oskrzelik za pomocą sterylnych kleszczyków, uważając, aby nie uszkodzić tkanki. Usuń jak najwięcej pozostałej tkanki miękkiej i pokrój tkankę na paski o szerokości ~5 mm za pomocą sterylnych nożyczek do rozwarstwiania.
21. Umieść wszystkie paski tkanki oskrzelowej w drugim płukaniu DMEM/RPMI 1640. Pozostaw w praniu na co najmniej 2 minuty.
22. Usuń paski tkanek z drugiego mycia za pomocą sterylnych kleszczy, uważając, aby nie uszkodzić tkanki. Umieść tkankę na czystej, sterylnej szalce Petriego.
23. Usuń pozostałą tkankę miękką przyczepioną do oskrzelików i pokrój paski na kwadraty (~5 mm x 5 mm) za pomocą sterylnych nożyczek do rozwarstwiania.
24. Dodaj trzecie płukanie DMEM/RPMI 1640 do szalki Petriego. Lekko wymieszaj kawałki chusteczki w praniu, obracając naczynie.
25. Wylej trzecie płukanie z szalki Petriego, nie usuwając kawałków tkanki.
26. Dodać końcowe płukanie SCFM do płytki Petriego zawierającej tkanki, upewniając się, że wszystkie kawałki tkanki są pokryte.
27. Sterylizuj kawałki tkanek w SCFM w świetle UV przez 5 minut.
28. Użyj sterylnych kleszczyków, aby przenieść każdy wysterylizowany fragment tkanki oskrzelikowej do pojedynczych dołków 24-dołkowej płytki / płytek zawierających płatki agarozowe SCFM.
29. Aby zainfekować każdy fragment tkanki pożądanym szczepem bakteryjnym, należy dotknąć kolonii wyhodowanej na płytce agarowej końcówką igły 29 G przymocowanej do sterylnej strzykawki insulinowej o pojemności 0,5 ml. Następnie dotknij kolonii na kawałku tkanki, delikatnie nakłuwając powierzchnię tkanki.
    nuta: Używanie strzykawki insulinowej wyposażonej w igłę 29 G pozwala na dokładne i wygodne trzymanie igły przy jednoczesnym utrzymaniu palców w bezpiecznej odległości zarówno od igły, jak i tkanki płucnej. Możliwe jest wykonanie tego kroku przy użyciu igieł 29 G, które nie są przymocowane do strzykawki, ale wymaga to większej zręczności i zwiększa ryzyko zranienia igłą. Strzykawki insulinowe są łatwo dostępne.
30. W przypadku niezakażonych osób z grupy kontrolnej delikatnie nakłuć powierzchnię każdego z kawałków tkanki końcówką igły 29 G przymocowanej do sterylnej strzykawki insulinowej o pojemności 0,5 ml.
31. Użyj pipety, aby dodać 500 μl SCFM do każdego dołka.
32. Sterylizuj oddychającą membranę uszczelniającą dla każdej 24-dołkowej płytki w świetle ultrafioletowym przez 10 minut (tabela materiałów).
33. Zdejmij pokrywkę z 24-dołkowej płytki i zastąp ją oddychającą membraną.
34. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez żądany czas inkubacji (infekcji) bez wstrząsania. Sprawdzić, czy na niezakażonych próbkach kontrolnych nie ma widocznego wzrostu zaszczepionego patogenu (kontrola skażenia).
    nuta: W razie potrzeby ampicylinę można dodać do płatków agarozowych SCFM i pokrywających SCFM w kroku 1.31 do końcowego stężenia 20 μg/ml. Spowoduje to zahamowanie wzrostu większości endogennych bakterii w płucach bez wpływu na wzrost P. aeruginosa lub S. aureus, ale ponieważ obecność ampicyliny może wpływać na wrażliwość na inne antybiotyki, czytelnik musi dokonać tego wyboru w zależności od szczepów i antybiotyków, które chce przetestować.

TABELA 1

1. Przygotowanie syntetycznych pożywek z plwociny CF (SCFM) do użycia z modelem płuc świni ex vivo

Po przygotowaniu, SCFM powinien być wysterylizowany filtrem, a następnie może być przechowywany w temperaturze 4°C przez okres do jednego miesiąca.

pkt. powiedział: powiedział: ) pkt. pkt. powiedział: powiedział: pkt.

a) Główny przepis
Krok 1	chemiczny	kwota	Instrukcje	Końcowy mM w 1L SCFM
	Zawartość NaCl	3,03 gr	Dodaj sole i wodę do czystej butelki, używanej tylko do przygotowania SCFM	Klasa 51,85
	Kcl	1.114 gr		14,94
	dH2O	Pojemność 640 ml		N/a
Krok 2	chemiczny	Molarność wywaru wyprodukowanego w wodzie, wysterylizowanego filtrem i przechowywanego w temperaturze 4°C	Instrukcje	Końcowy mM w 1L SCFM
	Na2HPO4	0,125 mln	Dodaj 10 ml każdego bulionu do soli i wody przygotowanych w kroku 1	Wydanie orzeczenia 1,25
	NaH2PO4	0,13 mln		Godzina 1,30
	NH4Cl (klasa zdrowia	0,228 mln		Pytanie 2,28
	Zobacz materiał KNO3	0,0348 mln		0,35
	Zobacz materiał K2SO4	0,0271 mln		0,27
	Mopy	1 mln		godz. 10.00
Krok 3	chemiczny		Instrukcje	Końcowy mM w 1L SCFM
	19 roztworów aminokwasów przygotowanych zgodnie z sekcją b)		Dodać 10 ml każdego bulionu do roztworu przygotowanego w krokach 1 i 2.	Patrz punkt b)
Krok 4	Chemiczny		Instrukcje	Końcowy mM w 1L SCFM
	HCl lub NaOH w zależności od potrzeb		Użyć do dostosowania pH roztworu przygotowanego w krokach od 1-3 do 6.8. Rekordowa objętość dodanego kwasu/zasady.	N/a
Krok 5	Chemiczny		Instrukcje	Końcowy mM w 1L SCFM
	dH2O		Dodać do roztworu przygotowanego w krokach 1-4 do końcowej objętości 960 ml	N/a
Krok 6	chemiczny	Molarność wywaru wyprodukowanego w wodzie, wysterylizowanego filtrem i przechowywanego w temperaturze 4°C	Instrukcje	Końcowy mM w 1L SCFM
	CaCl2	0,175 mln	Dodaj 10 ml każdego bulionu do roztworu przygotowanego w krokach 1-5	Pytanie 1,75
	MgCl2	0,0606 mln		0,61
Krok 7	chemiczny	Molarność wywaru wyprodukowanego w wodzie, wysterylizowanego filtrem i przechowywanego w temperaturze 4°C	Instrukcje	Końcowy mM w 1L SCFM
	Kwas L-mlekowy	0,93 mln	Zrób zapas w wodzie, pH do 7 z 5M NaOH. Dodać 10 ml do roztworu przygotowanego w krokach 1-6.	godz. 9.30
Krok 8	chemiczny	Molarność materiału roboczego wyprodukowanego w wodzie, bezpośrednio przed dodaniem do receptury	Instrukcje	Końcowy mM w 1L SCFM
	Fe(III)SO4,7H2O	0,00036 mln	Przygotować materiał wzorcowy o masie 0,036 M, który można sterylizować filtrem i przechowywać w temperaturze 4°C tak długo, jak długo roztwór pozostaje wolny od osadu. Aby przygotować materiał roboczy, należy dodać 110 μl bulwaru roboczego do 9,890 ml dH2O i dodać zapas roboczy do roztworu przygotowanego w krokach 1-7.	0,0036

TGL pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. TGL pkt. pkt. TGL pkt. TGL pkt. pkt. pkt. pkt. jezdnego pkt. TGL pkt. pkt. pkt. prócz pkt. pkt. pkt. pkt.

b) Przygotowanie zapasów aminokwasów; filtr sterylizować przed użyciem i przechowywać w temperaturze 4°C.
aminokwas	Zapasy mM	Instrukcje	Końcowy mM w 1 L SCFM
alanina	Rozdział 178	Rozpuścić w wodzie	1.780
arginina	30,6	Rozpuścić w wodzie	0,306
Asparaginian	82,7	Rozpuścić w 0,5 M NaOH	0,827
cysteina	16	Rozpuścić w wodzie	0,160
kwas glutaminowy	154,9	Rozpuścić w 1 M HCl	1,549
glicyna	120,3	Rozpuścić w wodzie	1,203
histydyna	51,9	Rozpuścić w wodzie	0,519
izoleucyna	112,1	Rozpuścić w wodzie, podgrzewając do 50°C przez 30 minut na wytrząsarce	1,121
leucyna	160,9	Rozpuścić w wodzie	1,609
lizyna	212,8	Rozpuścić w wodzie	Pytanie 2,128
metionina	63,3	Rozpuścić w wodzie	0,633
Ornityna-HCl	67,6	Rozpuścić w wodzie	0,676
fenyloalanina	53 Rozdział 53	Rozpuścić w wodzie	0,530
prolina	Rozdział 166	Rozpuścić w wodzie	1.660
seryna	144,6	Rozpuścić w wodzie	1,446
treonina	107,2	Rozpuścić w wodzie	1,072
tryptofan	1.3	Rozpuścić w 0,2 M NaOH	0,013
tyrozyna	80,2	Rozpuścić w 1M NaOH	0,802
walina	111,7	Rozpuścić w wodzie	Pytanie 1,117

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Strzykawki insulinowe - 0,5 ml z dołączoną igłą 29G.	Firma VWR	BDAM324892
24-dołkowe płytki hodowlane
70% etanol lub podobny do sterylizacji powierzchni i palenia sprzętu do preparacji
Płytki agarowe do przygotowania smug P. aeruginosa/S. aureus (dowolne odpowiednie podłoże)
Agarozy
Folia aluminiowa - wstępnie wysterylizowana w autoklawie - do przykrycia deski do krojenia, na której będziesz przeprowadzać sekcję płuc.
Membrana uszczelniająca Breathe-easy lub Breathe-easier do płytek wielodołkowych	Zdywersyfikowana biotechnologia	BEM-1 lub BERM-2000
Palnik Bunsena
Deska do krojenia - polecamy deskę z tworzywa sztucznego, aby umożliwić łatwą dekontaminację alkoholem.
Lodówka do transportu płuc do laboratorium
Nożyczki preparacyjne w różnych rozmiarach
Zmodyfikowane podłoże Eagle firmy Dulbecco (DMEM)
Duży nóż do palet
Zamontowane żyletki
Szalki Petriego
Plastikowa deska do krojenia i folia aluminiowa tworzą sterylną i łatwą do czyszczenia powierzchnię do rozwarstwiania
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 średni
Scfm			Składniki wymienione w tabeli 1
Dobór kleszczy (zalecane końcówki)
Odpowiednie pojemniki do usuwania zanieczyszczonych ostrych narzędzi i tkanki płucnej świni, zgodnie z Twojej instytucji Polityki bezpieczeństwa i higieny pracy.