$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Sekcja tkanki
- Przygotuj tkankę wieprzową, korzystając z niesterylnego obszaru roboczego do sekcji.
- Zaopatrz się w wyłuszczone oczy świni z lokalnej rzeźni, badań na zwierzętach lub od sprzedawcy. Podczas dostawy utrzymuj oczy na lodzie zanurzonym w PBS i użyj natychmiast po otrzymaniu.
- Odetnij tkankę zewnątrzoczodołową i przytnij spojówkę, pozostawiając tylko powłokę korowo-twardówkową i nerw wzrokowy. Wykonaj sekcję w niesterylnych warunkach za pomocą dużych nożyczek chirurgicznych i kleszczy w zestawie narzędzi do preparowania.
- Umieść oczy z powrotem w świeżym PBS na lodzie, aż wszystkie oczy wymagane do konfiguracji eksperymentalnej zostaną wstępnie wycięte.
- Zanurz oczy w 10% roztworze betadyny na 2 minuty w zamkniętych pojemnikach i przenieś aseptycznie do szafki BSC II w celu mikrodysekcji (szafka #1). Wszystkie kolejne prace należy wykonywać w sterylnych warunkach, aby zminimalizować zanieczyszczenia podczas konfiguracji.
- Sterylnie wypreparuj przednie segmenty.
- Po 2 minutach w roztworze betadyny przenieś oczy do trzech seryjnych płukań sterylnego 1x Antybiotyk-Antybiotyk-PBS (AA-PBS) w celu usunięcia nadmiaru roztworu betadyny z powierzchni oka przy zachowaniu sterylności tkanki oka. Po trzech praniach utrzymuj chusteczkę w AA-PBS do dalszego użycia.
- Hemisekcję oka za pomocą żyletki/skalpela i zakrzywionych nożyczek. Umieść oko na gazie nasączonej AA-PBS i wykonaj nacięcie sterylną żyletką lub skalpelem w pobliżu równika oka (podział 60/40 z 40 po stronie przedniej). Za pomocą zakrzywionych nożyczek chirurgicznych wykonaj półsekcję oka, aby wyizolować przednie oko (połowę rogówki).
nuta: Nacięcie wokół przedniego odcinka musi być ciągłe, aby zapobiec postrzępionym, szorstkim krawędziom twardówki, które będą powodować wycieki płynu po ustawieniu w hodowli narządów.
- Użyj mikronożyczek jako łopaty, aby nabrać ciało szkliste z przedniego odcinka. Usuń soczewkę z przedniego odcinka za pomocą mikronożyczek. Pozostaw przednie segmenty w AA-PBS do czasu dalszych etapów sekcji.
nuta: Wszystkie oczy, które zostaną poddane sekcji, można zatrzymać na tym etapie i jedno po drugim przeprowadzić przez pozostałą część procesu sekcji.
- Za pomocą mikroskopu preparacyjnego stopniowo przycinaj tęczówkę do korzenia tęczówki, promieniowo, aż do wyświetlenia siatki beleczkowej (TM). TM to pigmentowana tkanka, która składa się z włókien zorientowanych obwodowo wokół powłoki korowo-twardówkowej. Ostrożne nacięcia w tęczówce w kierunku korzenia tęczówki odsłonią głębokość TM pod tkanką.
- Wytnij 360° wokół tęczówki na tej samej głębokości, co początkowe nacięcie w tkance, aby odsłonić cały obszar TM. W razie potrzeby oczyść wszelkie pozostałe resztki tęczówki pokrywające TM.
- Przyciąć resztki ciała rzęskowego za TM, pozostawiając tylko cienki pasek tkanki z tyłu obszaru TM (około 1 mm).
- Umieść wypreparowany przedni segment (AS) w pożywce do czasu dalszego ustawienia w hodowli narządów przedniego segmentu (ASOC) w zespole naczynia Szafka BSC II (szafka #2).
nuta: W tym momencie można zatrzymać wszystkie oczy przed konfiguracją ASOC, jeśli pojedynczy użytkownik przeprowadza sekcję zwłok i montaż naczyń do hodowli narządów.