Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Ustawianie przednich segmentów w naczyniach do hodowli narządów
- Umieść pojedynczy przedni segment (AS) na szalce Petriego z odwróconym AS (miseczka do góry). Za pomocą bawełnianego wacika zwilż podłoże i delikatnie wklep w środek rogówki, aby usunąć pigment. Używając kleszczy do przytrzymania oka i tego samego wacika, przetrzyj bawełniany wacik wokół twardówki, aby usunąć dodatkowy pigment.
- Odwróć AS i umieść na wierzchu dolnej części naczynia nad podwyższonym obszarem, centrując rogówkę nad podwyższonym obszarem naczynia. Umieść clamppierścień na nowo umieszczonym AS.
- Umieść cztery w odpowiednich otworach, aby utrzymać pierścień na miejscu z AS pod pierścieniem. Delikatnie dokręć ręcznie za pomocą klucza trzpieniowego.
nuta: Etap dokręcania będzie odbywał się codziennie przez cały czas trwania eksperymentu, więc celem początkowego dokręcania jest upewnienie się, że media nie przeciekają, unikając jednocześnie zerwania pierścienia zaciskowego.
- Za pomocą sterylnego zestawu szalek Petriego umieść wierzch na naczyniu i odwróć ustawienie. Zamocuj stojak na naczynia. Przymocuj złącza fluidyczne z O-ringami do gwintowanych portów na spodzie naczynia.
- Do jednego złącza fluidycznego podłącz piastę igły 18 G wygiętą pod kątem 90°, długość rurki, piastę igły 18 G, nylonowy filtr strzykawkowy, zawór trójdrogowy i strzykawkę o pojemności 20 ml wypełnioną mediami.
- Do drugiego złącza fluidycznego podłącz piastę igły 18 G wygiętą pod kątem 90°, długość rurki, piastę igły 18 G, zawór trójdrogowy i część cylindryczną sterylnej strzykawki o pojemności 10 ml (będzie ona działać jako zbiornik do wyłapywania płynu i pęcherzyków z ASOC).
- Przy zaworach trójdrogowych otwartych odpowiednio do strzykawek, delikatnie przepchnij media przez system za pomocą portu złącza fluidics określonego w kroku 1.5, aby napompować AS, napełnić media w przewodach, a ostatecznie w zbiorniku.
nuta: Jeśli nośnik przecieknie do czaszy ASOC, AS nie jest wystarczająco mocno zabezpieczony za pomocą clamppierścienia.
- Usuń bąbelki, delikatnie wpychając pożywkę do naczynia i odwracając naczynie, aby wypchnąć bąbelki do zbiornika.
- Postaw naczynie i stań prosto. Umieść dolną część szalki Petriego pod nóżkami podstawy, uważając, aby nie zaplątać się w rurkę.
2. Rozpoczęcie hodowli narządów przedniego segmentu
- ASOC jest teraz gotowy do inkubacji. Umieścić naczynie ASOC w inkubatorze do hodowli komórkowych (37 °C, 5% CO2 ). Upewnij się, że wysokość czaszy ASOC w inkubatorze powyżej przetworników ciśnienia jest znana i uwzględniona, aby dokładnie obliczyć ciśnienie wewnątrzgałkowe (IOP).
- Przewody rurowe należy wyprowadzić przez spód drzwi inkubatora o temperaturze 37 °C, 5% CO2 , tak aby nie przeszkadzały w otwieraniu i zamykaniu drzwi. Podłączyć strzykawkę o pojemności 20 ml do zestawu pompy strzykawkowej o natężeniu 2,5 μl/min.
- Umieść przewód rurowy ze zbiornikiem na przyrządzie przetwornika ciśnienia. Podłącz boczny zawór 3-drogowy do konfiguracji przetwornika ciśnienia podczas przepływu PBS przez przewód, aby uniknąć przedostawania się pęcherzyków powietrza do przewodów.
nuta: Opróżnij PBS ze zbiorników po skonfigurowaniu systemu, aby zmniejszyć prawdopodobieństwo zanieczyszczenia zbiornika rozwojem drobnoustrojów na czas hodowli narządów.
- Rozpocznij zbieranie danych IOP, najpierw upewniając się, że karta microSD jest dostępna do zapisywania plików danych. Następnie włącz konfigurację przetwornika ciśnienia, aby rozpocząć zbieranie danych.
3. Codzienna konserwacja ASOC
- Po upływie 24 godzin od zrównoważenia przez ASOC wyjąć szalki z inkubatora o temperaturze 37 °C, 5% CO2 i umieścić je w komorze bezpieczeństwa biologicznego (BSC) II.
nuta: Podczas zbierania danych o ciśnieniu, te okresy wyglądają jak skoki, gdy ASOC są wyjmowane z inkubatora (zmiana wysokości) i regulowane w szafie.
- Sprawdź, czy pod każdym szalkiem na płytce Petriego nie ma wycieków. Jeśli występuje, sprawdź, czy pod naczyniem znajdują się szczelne połączenia płynów i w razie potrzeby ponownie dokręć. Sprawdź, czy nie ma wycieków w górnej części naczynia za pomocą sterylnego klucza trzpieniowego, aby dokręcić w clamppierścieniu.
nuta: Tkanka twardówki AS będzie kompresować i zmniejszać grubość o 24 godziny, a pierścień zaciskowy będzie musiał zostać dokręcony.
- Dobrze odessać pożywkę z naczynia.
nuta: Siatka beleczkowa filtruje płyn z mediów pompowanych do ASOC. W związku z tym pożywka będzie obecna w czaszy ASOC wzdłuż krawędzi.
- Powtórz kroki 1.7 i 1.8, aby usunąć wszelkie uwięzione pęcherzyki powietrza.
- Napełnij strzykawki na pompach strzykawkowych, upewnij się, że pompy strzykawkowe działają i potwierdź ustawienie zaworów perfuzji do ASOC. Umieścić szalkę ASOC z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
nuta: Optymalnie te kroki powinny być wykonywane codziennie. Jednak użycie początkowej objętości pożywki wynoszącej 20 ml, objętości studzienki czaszy ASOC i wydajności pompy 2,5 μl/min powinno wystarczyć, aby system działał bez zakłóceń przez kilka dni.
