Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Krojenie tkanek serca świni
- Ustaw kąpiel tkankową na wibratomie, dodaj lód do płaszcza chłodzącego do kąpieli tkankowej, a następnie dodaj roztwór Tyrode'a do kąpieli tkankowej. Ustaw plastikowy słoik o pojemności 1 l, aby zebrać odpady stopionego lodu z płaszcza chłodzącego do kąpieli tkankowej. Na 1 l roztworu Tyrode'a do krojenia zmieszać 3 g/l monoksymu 2,3-butanodionu (BDM), 140 mM NaCl (8,18 g), 6 mM KCl (0,447 g), 10 mM D-glukozy (1,86 g), 10 mM HEPES (2,38 g), 1 mM MgCl2 (1 ml 1 M roztworu), 1,8 mM CaCl2 (1,8 ml 1 M roztworu), do 1 L ddH2O. Doprowadzić pH do 7,40 za pomocą NaOH. Następnie przefiltrować roztwór za pomocą filtra próżniowego/systemu przechowywania o pojemności 1 000 ml i 0,22 μm i przechowywać go w temperaturze 4 °C przez noc.
- Pod komorą bezpieczeństwa biologicznego przenieś serce świni na tacę zawierającą 1 l świeżego zimnego roztworu kardioplegicznego. Na 1 l roztworu kardioplegicznego zmieszać 110 mM NaCl (6,43 g), 1,2 mM CaCl2 (1,2 ml 1 M roztworu), 16 mM KCl (1,19 g), 16 mM MgCl2 (3,25 g), 10 mM NaHCO3 (0,84 g), 1 U/ml heparyny, do 1 l ddH2O. Doprowadzić pH do 7,40 za pomocą NaOH. Następnie przefiltrować roztwór za pomocą filtra próżniowego/systemu przechowywania o pojemności 1 000 ml, 0,22 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C przez noc.
nuta: Dodaj 1,000 U/L heparyny do roztworu kardioplegii w dniu krojenia.
- Wypreparuj serce, aby wyizolować lewą komorę za pomocą wysuwanych sterylnych skalpeli. Następnie pokrój lewą komorę na bloki po 1−2 cm3 każdy za pomocą prostokątnych ostrzy brzytwy. Użyj jednego kawałka do krojenia, a pozostałe kawałki trzymaj w probówce o pojemności 50 ml w zimnym roztworze Tyrode'a na lodzie do późniejszego krojenia, jeśli zajdzie taka potrzeba.
nuta: Masuj tkankę przed krojeniem rękami, zwłaszcza jeśli jest to drugi blok. Masowanie pomaga przywrócić prawidłową konfigurację włókien mięśniowych i zapobiega sztywności w obrębie bloku serca.
- Dodaj 1−2 krople kleju tkankowego (tabela materiałów) do metalowego uchwytu na próbkę i przyklej kawałek 4% bloku agaru o powierzchni około 1cm2.
- Dodaj 1-2 krople kleju tkankowego na agar.
- Przyklej blok serca do agaru stroną z nasierdziem serca skierowaną w dół na kleju tkankowym i upewnij się, że jest tak płaski, jak to możliwe. Następnie przenieś uchwyt na tkankę z blokiem serca do jego pozycji w kąpieli krojącej wibratomu.
- Podłącz rurkę tlenową do kąpieli do krojenia i metalową tacę wypełnioną roztworem Tyrode'a do zbierania plastrów (natleniona kąpiel Tyrode'a). Następnie dodaj sitka o średnicy 40 μm do metalowej tacy, aby zebrać plastry po pokrojeniu.
- Regulacja pozycji krojenia
- Korzystając z oprogramowania do obsługi wibratomu i deski rozdzielczej, wyreguluj wysokość ostrza/próbki. Wybierz przycisk wysokości i postępuj zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie, aby dostosować wysokość. Idealnie, aby ostrze znajdowało się blisko górnej części tkanki, ale poniżej mięśni brodawkowatych i upewnij się, że płyn pokrywa tkankę i ostrze przed krojeniem.
- Dostosuj miejsce, w którym chcesz rozpocząć krojenie tkanki, wybierając przycisk postępu. Naciśnij przycisk krojenia i zwiększ prędkość za pomocą pokrętła, aby przesunąć ostrze w kierunku krawędzi chusteczki. Następnie ponownie naciśnij plasterek, aby zatrzymać, i naciśnij przycisk postępu, aby dezaktywować proces.
- Dostosuj parametry cięcia: prędkość posuwu = 0,03 mm/s, częstotliwość drgań = 80 Hz i amplituda drgań poziomych = 2 mm. Następnie rozpocznij krojenie, wybierając przycisk plasterka.
- Pozwól wibratomowi kroić, aż dotrze do końca tkanki, ale zanim uderzy w tylny koniec uchwytu próbki. W tym momencie ponownie naciśnij plasterek, aby zatrzymać. Naciśnij przycisk Return, aby wrócić do pozycji początkowej.
- Wybierz automatyczne powtarzanie (klikając go dwukrotnie), co pozwoli wibrującemu mikrotomowi automatycznie powtórzyć proces krojenia do 99 razy.
- Zbieranie plasterków
- Poczekaj, aż plastry będą na całej długości i będą dobrze wyglądać (po przejściu przez warstwy mięśni brodawkowatych), a następnie zacznij zbierać plasterki.
- Zbierz plastry za pomocą plastikowej pipety Pasteura wypełnionej zimnym roztworem Tyrode, aby delikatnie pobrać chusteczkę z kąpieli. W razie potrzeby użyj kleszczy i nożyczek sprężynowych, aby oddzielić plasterek od bloku serca, jeśli tkanka jest nadal przyczepiona.
- Przenieś plasterek do jednego sitka komórkowego w natlenionej kąpieli Tyrode'a (patrz krok 1.7) i użyj płynu w plastikowej pipecie Pasteura, aby tkanka leżała płasko na jednym z sitek do komórek, a następnie dodaj metalową podkładkę na górze, aby przytrzymać tkankę w dół.