Izolacja kompleksu oocytów Cumulusa świni: technika izolacji kompleksu oocytów Cumulus z pęcherzyka jajnika świni w celu zapłodnienia in vitro

Streszczenie

Źródło: Gorczyca, G. et al., Proteolitycznie zdegradowane hydrożele alginianowe i hydrofobowe mikrobioreaktory do enkapsulacji oocytów świń. J. Vis. Exp. (2020).

Ten film opisuje technikę izolowania kompleksu wzgórko-oocytów lub COC z jajników świni. Wyizolowany nienaruszony COC może być wykorzystany do przeprowadzenia zapłodnienia in vitro - techniki wspomaganego rozrodu w celu opracowania metod leczenia niepłodności.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Izolacja kompleksów cumulus-oocyty świń

1. Aby pobrać materiał do izolacji pęcherzyków jajnikowych, należy wyciąć jajniki świń od loszek przed okresem dojrzewania (w wieku około 6-7 miesięcy, o wadze od 70 do 80 kg) w lokalnej rzeźni. Wybierz około 20 jajników świni z 10 zwierząt do izolacji kompleksów wzgórko-oocytów (COC) w każdym eksperymencie.
   nuta: Zakładając, że każdy jajnik daje 3–5 pęcherzyków, całkowita liczba pęcherzyków waha się od 60 do 100.
2. Umieść jajniki w termosie ze sterylnym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS; pH 7,4; 38 °C) zawierającym 1% roztwór przeciwgrzybiczy (AAS). Zapewnić, że materiał doświadczalny zostanie przetransportowany do laboratorium w ciągu 1 godziny, gdzie zostanie dwukrotnie przepłukany sterylnym PBS zawierającym antybiotyki.
3. Po wypłukaniu jajników przenieść je do zlewki wypełnionej pożywką manipulacyjną (HM) (tabela materiałów) i przechowywać w inkubatorze w temperaturze 38 °C do czasu wszystkich manipulacji.
   nuta: W celu uzyskania optymalnych wyników podczas obchodzenia się z oocytami, wszystkie procedury należy przeprowadzić w pożywce DMEM/F12 (pożywce manipulacyjnej, HM) z dodatkiem 2,5% antybiotyku/AAS i 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i kontrolować pH na poziomie CO₂ w otoczeniu, na stole grzewczym z regulacją temperatury (38 °C) i pod okapem z przepływem laminarnym, aby zminimalizować zanieczyszczenie bakteryjne.
4. Z dużych pęcherzyków wieprzowych (o średnicy 6-8 mm) zebrać płyn pęcherzykowy (FF) przez aspirację i odwirowanie w dawce 100 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie przefiltrować supernatant za pomocą sterylnej strzykawki podłączonej do membranowych filtrów porowych 0,2 μm i zamknąć w temperaturze -80 ° C.
   nuta: Do aspiracji płynu pęcherzykowego należy użyć strzykawki insulinowej (u-40).
5. Upewnij się, że tylko zdrowe, średniej wielkości pęcherzyki (o średnicy 4-6 mm) są wybrane do izolacji COC.
   nuta: COC stopnia I, posiadające nienaruszony i okrągły oocyt z jednorodną ooplazmą i wielowarstwowymi (co najmniej 3-4) zwartymi wzgórkami, uważa się za odpowiednie do dalszej procedury 3D IVM.
6. Aby wyizolować COC, przenieś 2-3 jajniki na sterylną szalkę Petriego o średnicy 10 cm wypełnioną HM. Wyizoluj COC ze średniej wielkości pęcherzyków, postępując zgodnie z jedną z poniższych procedur.
   1. Delikatnie przeciąć powierzchnię wystających pęcherzyków jajnikowych sterylnym ostrzem chirurgicznym 15C. Spowoduje to, że płyn pęcherzykowy wraz z COC wypłynie na szalkę Petriego.
   2. Odessać zawartość pęcherzyków za pomocą igły 28 G o rozmiarze 5/8" dołączonej do jednorazowej strzykawki i przenieść ją na szalkę Petriego.
      nuta: Wyrzuć resztki tkanki jajnikowej. Kolejne etapy izolacji przeprowadzane są pod mikroskopem stereoskopowym.
7. Przygotuj 3–5 szalek Petriego IVF o średnicy 60 mm.
   1. Dodaj 1 ml HM do studzienek centralnych i umieść 3-4 krople HM (50 μl na kroplę) w ich zewnętrznych pierścieniach.
   2. Następnie, za pomocą mikropipety poliwęglanowej, przenieś nieuszkodzone COC do kropli HM w pierścieniach zewnętrznych, aby krótko je przepłukać 3-4 razy.
   3. Na koniec pojedynczo przenieś je do centralnej studni. Przechowuj te płytki IVF w inkubatorze do dalszych zabiegów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Ogólne
Antybiotyk Przeciwgrzybicze (100x) 100ml	Rybak termiczny	15240062	2,5% stężenie końcowe dla podłoża manipulacyjnego. 1% w PBS (krok 1.2)
DMEM/F12 (500 ml)	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał D8062	Obsługa medium
FCS (100 ml)	Rybak termiczny	16140063	10% stężenie końcowe dla medium manipulacyjnego. (krok: 1.5)
PBS (1x, pH 7,4) 500ml	Rybak termiczny	10010023
Podłoże do dojrzewania
hCG (1 fiolka 10 000 j.)	Sigma-Aldrich	CG10
PMSG (Międzynarodowa Organizacja Zarządzania	Dostawca biologiczny	RP1782721000
Konkretne instrumenty, narzędzia
Czasza Pteri 30 mm	TPP (TPP)	Numer katalogowy: 93040
60 mm IVF szalka Petriego	sokół	353653
inkubator	Panasonic	MCO-170AIC-PE	Można użyć innych marek
Sterylna szalka Petriego (10 cm)	NEST Biotechnologia	704002
termos	Keczua	5602589	Można użyć innych marek

powiedział: T