$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Enkapsulacja w superhydrofobowych mikrobioreaktorach z fluorowanym etylenem i propylenem (FEP).
UWAGA: Upewnij się, że wszystkie procedury dojrzewania in vitro (IVM) są przeprowadzane na stole kontrolowanym termostatycznie, a kompleksy wzgórko-oocyty (COC) są utrzymywane w temperaturze 38 °C przez cały czas ich obsługi.
- Przygotować szalkę Petriego o średnicy 30 mm zawierającą 5 g proszku FEP o średniej wielkości cząstek 1 μm
UWAGA: Ważne jest, aby używać świeżego proszku FEP. Ponownie wykorzystany FEP ma tendencję do agregacji i tworzenia grudek.
- Rozprowadzić pojedynczą kroplę pożywki dojrzewającej (MM) (~ 30 μl objętości) zawierającej 3-5 COC na złożu proszku FEP. Delikatnie obracaj płytkę ruchem okrężnym, aby upewnić się, że cząstki te całkowicie pokryły powierzchnię kropli cieczy i utworzyły się płynne kulki (LM).
- Uformowany LM pobrać za pomocą pipety z końcówką o pojemności 1 000 μl.
UWAGA: Przyciąć końcówkę pipety na krawędzi, aby dopasować ją do średnicy LM (4-5 mm). Przybliżona średnica tak przygotowanej końcówki powinna być nieco większa niż średnica LM.
- Przygotuj kilka szalek Petriego do zapłodnienia in vitro (IVF) 60 mm. Dodaj 3-4 ml sterylnej wody do zewnętrznych pierścieni, aby przygotować komorę wilgotności. Następnie umieść jeden LM w centralnej studzience.
UWAGA: Zabieg ten wymaga dobrych zdolności manualnych i precyzji - jeśli kulka zostanie ułożona nieostrożnie lub spadnie nawet z niewielkiej wysokości, zostanie zniszczona.
- Inkubować kulki przez 4 dni w temperaturze 38 °C w inkubatorze o stężeniu 5%CO2.
- Codziennie po zabiegu należy zmieniać pożywkę: nanieść 30 μl MM na każdy LM, co spowoduje ich rozprowadzenie, ponieważ bezpośredni kontakt z cieczą zaburza hydrofobowość powlekanych proszków FEP. Gdy zawartość marmuru się rozpuści, przenieś COC uwolnione z bioreaktora do kropli świeżego MM na szalce Petriego.
UWAGA: Aby precyzyjnie przenieść uwolnione COC, należy użyć mikropipety z poliwęglanu.
- Po kilku płukaniach w MM (3-4 razy) w celu usunięcia cząstek FEP, przenieś je wraz z 30 μl świeżego MM na złoże proszku FEP. Delikatnie obracaj płytkę ruchem okrężnym, aby upewnić się, że cząsteczki proszku całkowicie pokrywają powierzchnię kropli cieczy i tworzą nowy LM.
- Uformowany LM pobrać za pomocą pipety z końcówką o pojemności 1 000 μl.
- Dodaj 3-4 ml sterylnej wody do zewnętrznych pierścieni, aby przygotować komorę wilgotności. Następnie umieść jeden LM w centralnym dołku płytki Petriego do zapłodnienia in vitro.
UWAGA: Przezroczysta powłoka proszku FEP pozwala na monitorowanie zawartości LM za pomocą mikroskopu świetlnego.