System mikrobioreaktora z płynnego marmuru: protokół hodowli 3D do enkapsulacji oocytów świń

Streszczenie

Źródło: Gorczyca, G., et al. Proteolitycznie zdegradowane hydrożele alginianowe i hydrofobowe mikrobioreaktory do enkapsulacji oocytów świń. J. Vis. Exp. (2020).

W tym filmie opisujemy protokół enkapsulacji oocytów świń w hydrofobowych mikrobioreaktorach.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Enkapsulacja w superhydrofobowych mikrobioreaktorach z fluorowanym etylenem i propylenem (FEP).

UWAGA: Upewnij się, że wszystkie procedury dojrzewania in vitro (IVM) są przeprowadzane na stole kontrolowanym termostatycznie, a kompleksy wzgórko-oocyty (COC) są utrzymywane w temperaturze 38 °C przez cały czas ich obsługi.

1. Przygotować szalkę Petriego o średnicy 30 mm zawierającą 5 g proszku FEP o średniej wielkości cząstek 1 μm
   UWAGA: Ważne jest, aby używać świeżego proszku FEP. Ponownie wykorzystany FEP ma tendencję do agregacji i tworzenia grudek.
2. Rozprowadzić pojedynczą kroplę pożywki dojrzewającej (MM) (~ 30 μl objętości) zawierającej 3-5 COC na złożu proszku FEP. Delikatnie obracaj płytkę ruchem okrężnym, aby upewnić się, że cząstki te całkowicie pokryły powierzchnię kropli cieczy i utworzyły się płynne kulki (LM).
3. Uformowany LM pobrać za pomocą pipety z końcówką o pojemności 1 000 μl.
   UWAGA: Przyciąć końcówkę pipety na krawędzi, aby dopasować ją do średnicy LM (4-5 mm). Przybliżona średnica tak przygotowanej końcówki powinna być nieco większa niż średnica LM.
4. Przygotuj kilka szalek Petriego do zapłodnienia in vitro (IVF) 60 mm. Dodaj 3-4 ml sterylnej wody do zewnętrznych pierścieni, aby przygotować komorę wilgotności. Następnie umieść jeden LM w centralnej studzience.
   UWAGA: Zabieg ten wymaga dobrych zdolności manualnych i precyzji - jeśli kulka zostanie ułożona nieostrożnie lub spadnie nawet z niewielkiej wysokości, zostanie zniszczona.
5. Inkubować kulki przez 4 dni w temperaturze 38 °C w inkubatorze o stężeniu 5%_CO2.
   1. Codziennie po zabiegu należy zmieniać pożywkę: nanieść 30 μl MM na każdy LM, co spowoduje ich rozprowadzenie, ponieważ bezpośredni kontakt z cieczą zaburza hydrofobowość powlekanych proszków FEP. Gdy zawartość marmuru się rozpuści, przenieś COC uwolnione z bioreaktora do kropli świeżego MM na szalce Petriego.
      UWAGA: Aby precyzyjnie przenieść uwolnione COC, należy użyć mikropipety z poliwęglanu.
   2. Po kilku płukaniach w MM (3-4 razy) w celu usunięcia cząstek FEP, przenieś je wraz z 30 μl świeżego MM na złoże proszku FEP. Delikatnie obracaj płytkę ruchem okrężnym, aby upewnić się, że cząsteczki proszku całkowicie pokrywają powierzchnię kropli cieczy i tworzą nowy LM.
   3. Uformowany LM pobrać za pomocą pipety z końcówką o pojemności 1 000 μl.
   4. Dodaj 3-4 ml sterylnej wody do zewnętrznych pierścieni, aby przygotować komorę wilgotności. Następnie umieść jeden LM w centralnym dołku płytki Petriego do zapłodnienia in vitro.
      UWAGA: Przezroczysta powłoka proszku FEP pozwala na monitorowanie zawartości LM za pomocą mikroskopu świetlnego.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Podłoże do dojrzewania
hCG (1 fiolka 10 000 j.)	Sigma-Aldrich	CG10
PMSG (Międzynarodowa Organizacja Zarządzania	Dostawca biologiczny	RP1782721000
DMEM/F12 (500 ml)	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał D8062	Podłoże do dojrzewania
FCS (100 ml)	Rybak termiczny	16140063	10% stężenie końcowe dla pożywki do dojrzewania
Płynny marmur
Fep	Dyneon GmbH 3M AdMD	A-66670
Konkretne instrumenty, narzędzia
Szalka Petriego 30 mm	TPP (TPP)	Numer katalogowy: 93040
60 mm IVF szalka Petriego	sokół	353653
Ez-Grid Premium Pipettor do obsługi komórek	RI Nauki Przyrodnicze	8-72-288
Ez-Tip (Końcówka Ez)	RI Nauki Przyrodnicze	8-72-4155/20
inkubator	Panasonic	MCO-170AIC-PE	Można użyć innych marek
Sterylna szalka Petriego (10 cm)	NEST Biotechnologia	704002

powiedział: T