Selektywna ablacja wspomagana laserowo komórek śródbłonka rogówki świń: technika wywoływania skoncentrowanego uszkodzenia śródbłonka rogówki świni do badań ex vivo

Streszczenie

Źródło: Holzhey, A. et al., Opracowanie nieinwazyjnego, wspomaganego laserem eksperymentalnego modelu utraty komórek śródbłonka rogówki. J. Vis. Exp. (2020)

Ten film pokazuje nieinwazyjną procedurę wspomaganą laserem, która selektywnie uszkadza komórki śródbłonka rogówki w oku świni. Opracowany ex vivo model uszkodzenia komórek śródbłonka może być wykorzystany do badania chorób śródbłonka rogówki.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Przygotowanie hodowli narządowej i leczenie laserowe

1. Pobrać świeżo wyłuszczone oczy świni z lokalnej rzeźni. Utrzymuj je w chłodzie (4 °C) w zmodyfikowanym pożywce Eagle (DMEM) firmy Dulbecco o wysokiej zawartości glukozy, uzupełnionej L-glutaminą, pirogronianem sodu, penicyliną/streptomycyną (1%) i surowicą świńską (10%), zwaną dalej w tym artykule pełną pożywką.
2. Usuń tkanki zewnątrzkomórkowe nożyczkami i namocz oczy w 5% roztworze okulistycznym z jodowidonem na 5 minut przed umieszczeniem ich w wysterylizowanym roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do czasu użycia.
3. Monitoruj oczy pod kątem głównych patologii przedniego odcinka, takich jak bliznowacenie rogówki, obrzęk i inne zmętnienia za pomocą urządzenia do optycznej koherentnej tomografii w domenie spektralnej (tabela materiałów).
4. Ustaw oczy przed lampą szczelinową wyposażoną w laser Nd:YAG (Tabela materiałów), który ma długość fali 1,064 nm i średnicę ogniska 10 μm w powietrzu.
   nuta: Do optymalnego pozycjonowania stosuje się wydrukowany w 3D aparat podtrzymujący, który został zaprojektowany tak, aby mocno trzymać oko, bez wywierania na nie zbyt dużego nacisku (ryc. 1).
5. Użyj 12-krotnego powiększenia i odchyl oświetlenie, aby uwidocznić poszczególne warstwy rogówki.
6. Ustaw energię impulsu (np. 1.6 mJ) i punkt ostrości (np. 0.16 mm) do selektywnej ablacji komórek śródbłonka.
7. Umieść przezroczystą paracentezę rogówki w pobliżu rąbka i wstrzyknij lepkosprężystość (tabela materiałów), aby ustabilizować przednią komorę.
8. Wyciąć centralną rogówkę poddaną obróbce laserowej za pomocą trepanacji o średnicy 8 mm.
9. Umieścić wyciętą rogówkę w studzience na 12-dołkowej płytce ze śródbłonkiem skierowanym do góry i inkubować próbkę w 3 ml pełnej pożywki w temperaturze 37 °C przez okres do 3 dni.
   nuta: Na tym etapie do pożywki można dodać potencjalne środki cytoprotekcyjne.

Wyniki

Rysunek 1: Konfiguracja eksperymentalna.(A) Oczy zostały umocowane w częściowo wydrukowanym w 3D aparacie podtrzymującym, który umożliwiał precyzyjne ustawienie w stosunku do wiązki laserowej. (B) Przed leczeniem laserowym tkanka została oceniona za pomocą urządzenia do optycznej tomografii koherentnej przedniego odcinka w celu sprawdzenia głównych patologii przedni...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Trepanacja próżniowa Barrona	Kastena	Zobacz materiał K20-2058
Kriostat	Księga Leica	CM 3050S
Dulbecco's Modified Eagle's Medium - wysoki poziom glukozy	PAA (Agencja Ochrony	E-15009 (wersja angielska
Uchwyt na oko	jaźń	N/a
Mikroskop odwrócony	Księga Leica	DMI 6000 B
KH2PO4	Merck	529568
Na2HPO4	Merck	1065860500
Laser Nd:YAG	Zeiss Meditec	visuLAS YAG II plus
Technika tkankowa OCT	Sakura Finetechnical	Numer katalogowy: 4583
Penicylina-Streptomycyna	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał P4333
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)	Gibco (firma Gibco)	10010056
Surowica wieprzowa	Sigma-Aldrich	12736C
Optyczna tomograf koherentna w domenie spektralnej	Inżynieria w Heidelbergu	Widmo
Płytka do hodowli tkankowej 12-dołkowa	Sarstedt	833921
Lepkosprężystych	Omnivision	Methocel powiedział:

T ) powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: