Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Izolacja komórek śródbłonka aorty świń
- W warunkach aseptycznych należy wyjąć aortę świni z bufora do płukania i umieścić ją na szalce Petriego o średnicy 150 mm (ryc. 1A).
- Delikatnie odetnij dwa końce aorty i ponownie wytnij nadmiar tkanki wokół aorty za pomocą sterylnych kleszczyków i nożyczek (ryc. 1B). Przemyć zewnętrzną i wewnętrzną stronę aorty (nad naczyniem hodowlanym w temperaturze pokojowej) 20−50 ml buforu do mycia: 1x roztwór PBS (pH 7,4) z 1% (v/v) penicyliną/streptomycyną.
nuta: Staraj się ciąć tylko obszar, w którym umieszczono zaciski podczas operacji, ponieważ niektóre EC zostały uszkodzone w tym obszarze, i usuń nadmiar tkanek i bocznych gałęzi tętnic.
- Przeprowadź szew chirurgiczny przez aortę, a następnie zawiąż jeden koniec aorty za pomocą szwu chirurgicznego (5-0, 90 cm, tabela materiałów). Utrzymuj szew chirurgiczny we wnętrzu aorty (ryc. 1C,D).
- Delikatnie przymocuj aortę w pobliżu zawiązanego końca za pomocą kleszczy, a następnie powoli pociągnij szew chirurgiczny, aby odwrócić aortę, aż powierzchnia śródbłonka aorty zostanie odsłonięta (ryc. 1E−G).
nuta: Upewnij się, że aorta jest zamocowana w pobliżu zawiązanego końca i nie mocuje aorty mocno, w przeciwnym razie aorty nie można odwrócić, pociągając za szew chirurgiczny.
- Przemyj powierzchnię śródbłonka aorty buforem do przemywania 3x (10 ml na płukanie), a następnie wyrzuć ten roztwór. Umieść aortę w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml i przykryj aortę 10 ml 0,005% roztworu trawiennego kolagenazy dożylnej w probówce (ryc. 1H).
nuta: Przed strawieniem podgrzej 0,005% roztwór trawienny kolagenazy dożylnie w temperaturze 37 °C.
- Inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut. Umieścić strawioną aortę i roztwór trawienny w naczyniu hodowlanym o średnicy 100 mm i zatrzymać działanie 0,005% kolagenazy dożylnej, dodając 10−15 ml wstępnie schłodzonego buforu zatrzymującego: zmodyfikowaną pożywkę Eagle's (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnioną 10% inaktywowanym termicznie FBS i 1% P/S.
nuta: Zalecany czas trawienia wynosi od 10 do 20 minut. Upewnij się, że powierzchnia śródbłonka aorty jest pokryta buforem zatrzymującym.
- Delikatnie zeskrob pAEC z wewnętrznej powierzchni aorty za pomocą skrobaka do komórek (Rysunek 1I). Przemyj zeskrobaną aortę 3x buforem do przemywania (5 ml na raz). Umieść roztwór z naczynia hodowlanego do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Umyj dno naczynia hodowlanego 2x buforem myjącym (5 ml na raz) i ponownie umieść roztwór w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml.
nuta: Delikatnie zeskrobać w jednym kierunku i nie uciskać. Nie dotykaj chusteczki w pobliżu krawędzi i otworów. Zaleca się skrobanie 5−8x.
- Odwirować probówkę o stężeniu 600 x g przez 6 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i pozostawić 10 ml roztworu na dnie probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Dodać 20 ml buforu myjącego do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i ponownie zawiesić granulki. Na tym etapie unikaj bąbelków.
- Wirować przy 600 x g przez 6 minut w temperaturze 4 °C. Powoli wyrzucić supernatant. Zawiesić osady komórkowe w 1 ml pożywki hodowlanej i dobrze wymieszać.
nuta: Uzyskana średnia liczba EC na cm aorty wynosi 1,9 x 10⁵ ± 1,4 x 10⁴ (średnia ± SD, n = 3).
- Policz komórki za pomocą licznika komórek. Płytkie i hodowla komórek w naczyniu bez powlekania jakimikolwiek materiałami zgodnie z numerem komórki. Jeśli liczba komórek jest mniejsza lub równa 1,0 x 10⁶, hoduj komórki w kolbie o powierzchni 25 cm². Jeśli liczba komórek jest większa niż 1,0 x 10⁶, hoduj komórki w kilku kolbach o powierzchni 25 cm² (1,0 x 10⁶ komórek na kolbę). Umieścić kolbę w inkubatorze (bez wstrząsania) w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ i wymieniać pożywkę co 2-3 dni.
nuta: Niektóre komórki są uszkadzane przez skrobak do komórek. Test żywotności komórek wykazał, że odsetek żywych komórek wynosi 95,7% ± 1,7% (średnia ± SD, n = 3). Czas podwajania izolowanych komórek wynosi około 1−2 dni.
