$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Izolacja krótkich tylnych tętnic rzęskowych
Oczy świni wraz z nerwem wzrokowym i tkankami zewnątrzgałkowymi zostały uzyskane natychmiast po sekcji zwłok. Wyłuszczone oczy przetransportowano do laboratorium w lodowatym roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i natychmiast użyto.
UWAGA: Oko świni jest zasadniczo podzielone na część przednią (Rysunek 1A) i tylną (Rysunek 1B).
- Umieść gałkę oczną w komorze preparacyjnej zawierającej lodowaty bufor Krebs-Henseleit (K-H). Ostrożnie odetnij otaczające mięśnie i tkanki ostrymi nożyczkami Mayo.
nuta: Aby przygotować bufor Krebsa-Henseleita (K-H), należy odważyć następujące substancje chemiczne (27,68 g NaCl, 8,4 g NaHCO, 3,1,4 g KCl, 1,18 gMgSO4 i 0,64 g KH2PO4) do jednej suchej i czystej stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i 1,47 g CaCl2 i 8,0 g glukozy do drugiej probówki. Mieszaninę tych chemikaliów w proszku należy przechowywać w chłodnym i suchym miejscu. Mieszaninę CaCl2 i glukozy w proszku najlepiej przygotować na świeżo, aby zapobiec wchłanianiu wilgoci i zbrylaniu.
- Wykonaj nacięcie skalpelem i przetnij kulę ziemską wzdłuż płaszczyzny równikowej ostrymi nożyczkami Mayo, aż oko zostanie rozdzielone na przednią i tylną połowę. Usuń jak najwięcej ciała szklistego z tylnej połowy oka za pomocą pary standardowych kleszczy.
nuta: Rozdzielenie gałki ocznej na dwie połówki ułatwia izolację krótkich tylnych tętnic rzęskowych (sPCA) bez konieczności posiadania ruchomego oka w naczyniu separacyjnym. Ten krok nie jest jednak obowiązkowy. Naczynia można również odizolować bez otwierania gałki ocznej.
- Użyj szpilek preparacyjnych, aby ostrożnie przygwoździć tylną połowę oka siatkówką skierowaną w dół i nerwem wzrokowym skierowanym do góry w kierunku eksperymentatora.
- Delikatnie odetnij tkanki łączne otaczające nerw wzrokowy, aby odsłonić leżące pod spodem unaczynienie zagałkowe za pomocą nożyczek sprężynowych Student Vannas.
- sPCA może być postrzegana jako krótkie gałęzie naczyń (od 5 do 8 gałęzi), które przenikają do twardówki i obwodowo otaczają głowę nerwu wzrokowego (ryc. 1C). Odizoluj przywzrokową i dystalną sPCA wraz z otaczającymi tkankami łącznymi za pomocą pary precyzyjnych pęset typu 5 i nożyczek do kapsulotomii Vannas (ryc. 1D).
nuta: Upewnij się, że bufor K-H pozostaje lodowaty przez cały czas trwania procedury izolacji. Zdecydowanie zaleca się wymianę bufora co 20-30 minut, w zależności od temperatury otoczenia.
2. Przygotowanie próbki
- Delikatnie usuń tkanki łączne z odcinków tętniczych za pomocą precyzyjnej pęsety typu 5 o bardzo cienkiej końcówce i nożyczek do kapsulotomii Vannas pod mikroskopem stereoskopowym i przepłucz izolowane tętnice w lodowatym PBS, aby usunąć zanieczyszczenia i pozostałości krwi.
nuta: Jeśli próbki nie zostaną natychmiast poddane kolejnym etapom, należy je błyskawicznie zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu dalszego użycia.
