Knockdown genów za pośrednictwem RNA za pośrednictwem krótkiej spinki do włosów w iHSPC in vitro: system ekspresji shRNA oparty na lentiwirusie dostarczany do iHSPC w celu wyeliminowania określonej ekspresji genów

Streszczenie

Źródło: Hsiao, Y. L., et al. Badanie rozwoju komórek dendrytycznych przez krótki knockdown genów za pośrednictwem RNA w linii komórek macierzystych i progenitorowych in vitro. J. Vis. Exp. (2022).

W tym filmie demonstrujemy metodę przeprowadzania transdukcji wektorów lentiwirusowych shRNA w celu uzyskania stabilnych linii komórkowych knockdown w unieśmiertelnionych hematopoetycznych komórkach macierzystych i progenitorowych (iHSPC).

Protokół

1. Przygotowanie unieśmiertelnionych linii komórek macierzystych i progenitorowych (iHSPCs)

1. Utrzymuj linię komórkową iHSPC w kompletnym pożywce RPMI 1640 zawierającej 100 ng / ml FL i 1 μM β-estradiolu.
2. Przenikaj komórki w stosunku 1:10 co 3 dni.
   nuta: Przygotuj kompletną pożywkę RPMI 1640, uzupełniając 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 5 ^x10-5 M β-merkaptoetanolu i 10 μg/ml gentamycyny. Rekombinowany mysi FL jest również dostępny na rynku.

2. Transdukcja lentiwirusowa

1. Płytki iHSPC o gęstości 1 x 10⁵ komórek/basenik na pł....

Wyniki

Rycina 1: Konstrukt wektora lentiwirusowego pLKO.1-Puro.

....

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Mikroprobówka 1,5 ml	ExtraGene (Pozagen)	RURKA-170-C
12-dołkowa płytka poddana kulturze tkankowej	sokół	353043
Surowica płodowa bydlęca (FBS)	Corning	35-010-CV
RPMI 1640 średni	Gibco (firma Gibco)	Numer katalogowy 11875-085
β-estradiol	Sigma-Aldrich	E2758-250MG
β-merkaptoetanol (β-ME)	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał M6250
Ligand Flt3 (FL)	Domowej roboty
Polibrene	Sigma-Aldrich	TR-1003-G
Puromycyna	Szczepionka Invivogen	ANT-PR-1
shId2 (GCTTATGTCGAATGATAGCAA/TRCN0000054390)	Konsorcjum RNAi (TRC)
shLacZ (CGCGATCGTAATCACCCGAGT/TRCN0000072224)	Konsorcjum RNAi (TRC)
shTcf4 (GCTGAGTGATTTACTGGATTT/TRCN0000012094)	Konsorcjum RNAi (TRC)

powiedział: