Knockdown genów za pośrednictwem RNA za pośrednictwem krótkiej spinki do włosów w iHSPC in vitro: system ekspresji shRNA oparty na lentiwirusie dostarczany do iHSPC w celu wyeliminowania określonej ekspresji genów

Streszczenie

Źródło: Hsiao, Y. L., et al. Badanie rozwoju komórek dendrytycznych przez krótki knockdown genów za pośrednictwem RNA w linii komórek macierzystych i progenitorowych in vitro. J. Vis. Exp. (2022).

W tym filmie demonstrujemy metodę przeprowadzania transdukcji wektorów lentiwirusowych shRNA w celu uzyskania stabilnych linii komórkowych knockdown w unieśmiertelnionych hematopoetycznych komórkach macierzystych i progenitorowych (iHSPC).

Protokół

1. Przygotowanie unieśmiertelnionych linii komórek macierzystych i progenitorowych (iHSPCs)

1. Utrzymuj linię komórkową iHSPC w kompletnym pożywce RPMI 1640 zawierającej 100 ng / ml FL i 1 μM β-estradiolu.
2. Przenikaj komórki w stosunku 1:10 co 3 dni.
   nuta: Przygotuj kompletną pożywkę RPMI 1640, uzupełniając 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 5 ^x10-5 M β-merkaptoetanolu i 10 μg/ml gentamycyny. Rekombinowany mysi FL jest również dostępny na rynku.

2. Transdukcja lentiwirusowa

1. Płytki iHSPC o gęstości 1 x 10⁵ komórek/basenik na płytkach 12-dołkowych w 1 ml kompletnej pożywki zawierającej 100 ng/ml FL, 1 μM β-estradiolu i 8 μg/ml polibrenu.
   nuta: Stężenie polibrenu zależy od typu komórek i zwykle mieści się w zakresie 4-8 μg/ml.
2. Dodaj lentiwirusa przenoszącego shRNA do każdej studzienki przy wielokrotności infekcji (MOI) 100,
   nuta: Wektorem lentiwirusowym jest pLKO.1-Puro z markerem selekcyjnym puromycyny (ryc. 1). Docelowe sekwencje shRNA przeciwko odpowiednio LacZ, Tcf4 i Id2 są wymienione w tabeli materiałów. MOI jest definiowany przez liczbę wirionów, które są dodawane na komórkę podczas infekcji.
   
3. Obracać płytki w temperaturze 1 100 x g przez 90 minut w temperaturze 37 °C.
4. Inkubować płytkę zawierającą zakażone komórki przez noc w temperaturze 37 °C w inkubatorze.
   nuta: Jeśli komórki są wrażliwe na polibren, po infekcji spinowej należy je odświeżyć kompletną pożywką bez polibrenu.
5. Odświeżyć komórki kompletną pożywką zawierającą 100 ng/ml FL i 1 μM β-estradiolu 24 godziny po zakażeniu.
6. Dodaj 6 μg/ml puromycyny do pożywki, aby wybrać zakażone komórki po dodatkowych 24 godzinach
   nuta: Transdukowany wektor lentiwirusowy zwykle potrzebuje 48 godzin na ekspresję genów, w tym genu oporności na puromycynę. Upewnij się, że stężenie puromycyny jest zoptymalizowane dla każdej linii komórkowej.
7. Odświeżaj pożywkę selekcyjną zawierającą 100 ng/ml FL, 1 μM β-estradiolu i 6 μg/ml puromycyny co 3 dni i utrzymuj komórki przez co najmniej tydzień, aby rozszerzyć stabilnie transdukowane komórki iHSPC.
   nuta: Selekcja puromycyny następuje zwykle 48 godzin później, a okres selekcji zależy od typu komórek.

Wyniki

Rycina 1: Konstrukt wektora lentiwirusowego pLKO.1-Puro.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Mikroprobówka 1,5 ml	ExtraGene (Pozagen)	RURKA-170-C
12-dołkowa płytka poddana kulturze tkankowej	sokół	353043
Surowica płodowa bydlęca (FBS)	Corning	35-010-CV
RPMI 1640 średni	Gibco (firma Gibco)	Numer katalogowy 11875-085
β-estradiol	Sigma-Aldrich	E2758-250MG
β-merkaptoetanol (β-ME)	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał M6250
Ligand Flt3 (FL)	Domowej roboty
Polibrene	Sigma-Aldrich	TR-1003-G
Puromycyna	Szczepionka Invivogen	ANT-PR-1
shId2 (GCTTATGTCGAATGATAGCAA/TRCN0000054390)	Konsorcjum RNAi (TRC)
shLacZ (CGCGATCGTAATCACCCGAGT/TRCN0000072224)	Konsorcjum RNAi (TRC)
shTcf4 (GCTGAGTGATTTACTGGATTT/TRCN0000012094)	Konsorcjum RNAi (TRC)

powiedział: