Kompleksowa edycja genomu CRISPR: metoda homologii sterowanej naprawą genów w hodowanych komórkach przy użyciu systemu CRISPR-Cas9

Streszczenie

Źródło: Zhang, L. et al, Gene knock-in by CRISPR/Cas9 and Cell Sorting in Macrophage and T Cell Lines. J. Vis. Exp. (2021).

W tym filmie demonstrujemy edycję genomu opartą na CRISPR-Cas9 w hodowanych komórkach, gdzie Cas9 i sgRNA są dostarczane jako pojedynczy konstrukt plazmidowy do komórek. System CRISPR-Cas9 i pożądany gen, który ma zostać wstawiony, został wprowadzony do komórek za pomocą techniki elektroporacji, aby ułatwić pomyślną edycję genów.

Protokół

1. Elektroporacja makrofagów i linii limfocytów T

1. Przygotowanie kultur komórkowych do elektroporacji
   1. Przygotuj Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 uzupełniony 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) jako kompletną pożywkę wzrostową dla limfocytów T Jurkat. Przygotuj zmodyfikowane podłoże Dulbecco Eagle Medium (DMEM) z 10% FBS do hodowli makrofagów RAW264.7. Uzupełnij wszystkie kompletne pożywki wzrostowe penicyliną o stężeniu 100 μg/ml i streptomycyną o stężeniu 100 μg/ml (Pen/Strep), z wyjątkiem pożywek stosowanych do inkubacji po transfekcji przed sortowaniem komórek.
   2. Wykonaj subkulturację limfocytów T RAW264.7 i Jurkat zgodnie z instrukcjami dostawcy (patrz tabela materiałów). Podczas subhodowli komórek RAW264.7 użyj roztworu trypsyny-EDTA (0,25%) do odłączenia komórek. Użyj FBS uzupełnionego 10% (v/v) DMSO jako pożywki do kriokonserwacji dla komórek RAW264.7 i Jurkat.
   3. Zbieraj komórki w ilości 250 × g przez 5 minut dla makrofagów RAW264.7 i 90 × g przez 8 minut dla limfocytów T Jurkat. Następnie przemyć 5-10 ml 1× DPBS (bez jonów^Ca2+ lub^Mg2+). Usuń DPBS.
   4. Zawiesić osad komórkowy za pomocą 2 ml 1× DPBS. Użyj 10 μl komórek i wymieszaj z równą objętością 0,2% błękitu trypanowego, aby oszacować liczbę komórek i ich żywotność.
      nuta: Upewnij się, że hodowla komórkowa ma >90% żywotności w dniu transfekcji.
   5. W przypadku pojedynczego eksperymentu knock-in należy wykonać elektroporację za pomocą 10 μl końcówek nukleofekcyjnych z pięcioma powtórzeniami. Obliczyć objętość potrzebną na 2,0 × 106 komórek i zagnieździć komórki przez odwirowanie. Ponownie umyj osad komórkowy za pomocą 1× DPBS, jak opisano w kroku 1.1.2.
      nuta: W przypadku stosowania końcówek nukleofekcyjnych o pojemności 10 μl potrzeba 4,0 × 10⁵ ogniw na elektroporację. W związku z tym przygotuj co najmniej 2,0 × 10⁶ komórek na jeden eksperyment knock-in.
   6. Przygotować 24-dołkową płytkę z 0,5 ml kompletnego podłoża wzrostowego (przygotowanego w kroku 1.1.1) na dołek bez wstrzykiwacza/paciorkowca i podgrzać w inkubatorze o temperaturze 37 °C.

2. Elektroporacja komponentów CRISPR/Cas9 i wektora celowania

1. Włącz system elektroporacji. Użyj parametrów elektroporacji zoptymalizowanych w następujący sposób: 1,400 V/20 ms/2 impulsy dla makrofagów RAW264.7 i 1350 V/20 ms/2 impulsy dla limfocytów T Jurkat.
2. Biorąc pod uwagę ubytek próbki spowodowany pipetowaniem, należy przygotować mieszaninę do elektroporacji o objętości 55 μl w sterylnej probówce mikrowirówki o pojemności 1,5 ml zawierającej 2,5 μg każdego wektora CRISPR/Cas9 (pDsR-mR26-sg1 i pDsR-mR26-sg2 dla mRosa26 locus knock-in oraz pDsR-hR26-sg1 i pDsR-hR26-sg2 dla locus hROSA26), 2,4 μg linearyzowanego wektora celowania (pKR26-POI-iBFP lub pKhR26-POI-iBFP dla mRosa26 i hROSA26knock-in, linearyzowany przez EcoRI lub BamHI) oraz bufor do zawieszania R.
   nuta: Aby zaoszczędzić czas, mieszaninę do elektroporacji można przygotować podczas wirowania (krok 1.1.5).
3. Zawiesić 2,0 ×^{10 6} ogniw (przygotowanych w kroku 1.1.5) w mieszaninie do elektroporacji o objętości 55 μl z kroku 1.2.2.
4. Odessać mieszaninę ogniwo/elektroporacja z kroku 1.2.3 za pomocą końcówki do nukleofekcji o pojemności 10 μl z pipetą.
   nuta: Podczas pipetowania należy unikać wprowadzania pęcherzyków powietrza, które mogą spowodować awarię elektroporacji.
5. Dodać próbkę do probówki wypełnionej 3 ml buforu E z zestawu do elektroporacji.
6. Zastosuj parametry elektroporacji dla dwóch typów ogniw zgodnie z opisem w kroku 1.2.1.
7. Przenieść próbkę do jednego dołka na 24-dołkowej płytce ze wstępnie podgrzanym podłożem z kroku 1.1.6.
8. Powtórz kroki 1.2.4-1.2.7 dla pozostałych czterech powtórzeń, a także tylko dla kontrolek wektora docelowego i tylko wektora wyrażenia CRISPR.
   nuta: Zmień końcówkę nukleofekcji i rurkę podczas przełączania na inny typ komórki / plazmidowe DNA.
9. Hodować transfekowane komórki przez 48-72 godziny, aby umożliwić odzysk po elektroporacji i ekspresji składników CRISPR/Cas9 przed analizą cytometrii przepływowej lub sortowaniem komórek aktywowanym fluorescencją (FACS).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Ampicylina, sól sodowa	MP Biomedycyna	194526
Celometr Mini automatyczny licznik komórek	Nexcelom Bioscience
DPBS (10X), bez wapnia, bez magnezu	ThermoFisher Naukowy	14200075
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) o wysokiej zawartości glukozy	Klon HyClone	SH30022.01
Falcon 5 ml probówka z okrągłym dnem z polistyrenu	BD Nauki biologiczne	352003
Surowica płodowa bydlęca (FBS)	ThermoFisher Naukowy	10099141
Jurkat	Kontroler ATCC (Kontroler T	TIB-152	https://www.atcc.org/
Siarczan kanamycyny	MP Biomedycyna	194531
Pipeta wielokanałowa (30-300 μL)	Eppendorf lub podobny
System transfekcji neonów	ThermoFisher Naukowy	MPK5000
System transfekcji neonu, zestaw 10 μL	ThermoFisher Naukowy	MPK1096
Nunc 15 ml stożkowe sterylne probówki wirówkowe	ThermoFisher Naukowy	339651
Końcówka do pipet 0,1-20 μl	Eppendorf lub podobny	0030 075.005
Końcówka do pipet 2-200μl	Eppendorf lub podobny	0030 075.021
Końcówka do pipet 50-1000μl	Eppendorf lub podobny	Numer telefonu 0030 075.064
pX458-DsRed2	Addgene powiedział:	112219
RAW264.7	Kontroler ATCC (Kontroler T	TIB-71	https://www.atcc.org/
RPMI 1640 Średni	Klon HyClone	SH30027.01
Penicylina-Streptomycyna	ThermoFisher Naukowy	15140122
Roztwór błękitu trypanowego, 0,4%	ThermoFisher Naukowy	15250061
Mikroprobówki 1,5 ml, czyste PCR	Eppendorf lub podobny	Numer katalogowy: 0030 125.215
24-dołkowe, przezroczyste, wielodołkowe płytki wielodołkowe nasączone TC	Corning	3524

powiedział: TGL