Edycja genomu oparta na nukleazie palca cynkowego: technika modyfikacji genomu w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych za pomocą dwuniciowego mechanizmu naprawy zależnego od homologii

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Przygotuj komórki macierzyste do edycji

1. Hodować i hodować ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste (hPSC) na 6-dołkowej płytce zawierającej 2,4 × 10⁶ komórek/płytkę inaktywowanych przez mitomycynę C-inaktywowanych mysich fibroblastów zarodkowych (MEF) hodowanych na żelatynie. Utrzymać hPSC w 3 ml pożywki z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych na studzienkę (pożywka hESC) i hodować w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 3% O₂/5% CO₂,
   nuta: Aby ten protokół był skuteczny, nie jest konieczne utrzymywanie hPSC w inkubatorze o niskiej zawartości tlenu; jednak ważne jest, aby pamiętać, że hPSC namnażają się szybciej w środowisku o wysokim poziomie_O2, więc czas i liczba komórek powinny być odpowiednio dostosowane. Należy również zauważyć, że hPSC utrzymywane w niskiej zawartości tlenu mają niższe wskaźniki spontanicznego różnicowania.
   1. Aby przygotować 500 ml pożywki hESC, połącz 380 ml DMEM/F12, 75 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 25 ml zamiennika surowicy nokautującej (KSR). Dodaj glutaminę (1 mM stężenie końcowe), 5 ml 100x aminokwasy endogenne, 100 jednostek/ml penicyliny-streptomycyny (P/S), zasadowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF) (stężenie końcowe 4 ng/ml) i 2-merkaptoetanol (stężenie końcowe 5,5 μM).
2. Zmień pożywkę, usuwając całą objętość pożywki (3 ml) za pomocą szklanej pipety i odkurzyć. Zastąp 3 ml ciepłym pożywką hESC za pomocą pipety serologicznej. Powtarzaj zmianę pożywki codziennie, aż hPSC osiągną około 50% zlewu (dzień-1).
3. Na dzień przed celowaniem (Dzień-1) zmień pożywkę hESC, usuwając starą pożywkę i dodając ciepłą pożywkę hESC uzupełnioną 10 μM Y-27632.
4. Również w dniu -1 przygotuj jedną lub dwie 6-dołkowe lub 10-centymetrowe płytki lekoopornych komórek zasilających MEF od myszy DR4 (2,4 × 10⁶ komórek/płytkę).
   Uwaga: Ogólnie rzecz biorąc, płytki 6-dołkowe są lepsze niż płytki 10 cm, ponieważ mieszczą więcej pożywki. Płytki 6-dołkowe zapewniają również, że różne klony z różnych studni są niezależne. Jednak płytka o średnicy 10 cm pozwoli na łatwiejsze zbieranie, w zależności od mikroskopu dostępnego do tego procesu.

2. Edycja pluripotencjalnych komórek macierzystych

1. Przygotować roztwory do transfekcji, pipetując po 5 μg ZFN 1 i 2 (ryc. 1) do probówki o pojemności 1,5 ml. Odpipetować 30 μg plazmidu naprawczego również do tej probówki. Na koniec odpipetować 1x sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) do probówki, aby zwiększyć objętość do 300 μl.
   nuta: Przygotować plazmidy jako midiprep (odpowiedni jest dowolny zestaw) o minimalnym stężeniu 300 ng/μl, aby utrzymać całkowitą objętość roztworu transfekcji poniżej 300 μl. Nie jest konieczne przeprowadzanie ekstrakcji fenolu/chloroformu, linearyzacja plazmidu ani stosowanie zestawu do przygotowania plazmidu wolnego od endotoksyn.
2. Usuń pożywkę z hPSC za pomocą szklanej pipety i odkurz. Odpipetować 2 ml ciepłej 1x PBS do każdej studzienki, aby umyć komórki.
3. Natychmiast wyjmij PBS za pomocą szklanej pipety i odkurz. Dodaj 0,5 ml 0,25% roztworu trypsyny-EDTA bezpośrednio na komórki w każdym dołku. Umieścić w inkubatorze (37 °C/5% CO₂ / 3% O₂) na około 10 minut lub do momentu, gdy warstwa podajnika zacznie odnosić się od płytki.
4. Dodaj 2 ml ciepłej pożywki esWash (470 ml DMEM/F12, 25 ml FBS, 100 jednostek/ml P/S) do każdej studzienki, aby zatrzymać reakcję trypsyny.
5. Upewnij się, że komórki podajnika są zdejmowane jako arkusz. Odpipetować zawartość każdej studzienki do jednej stożkowej probówki o pojemności 50 ml, łącząc wszystkie studzienki. Roztrzeć komórki za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml. Nie ma potrzeby rozbijania warstwy zasilającej; hPSC odpadną z warstwy zasilającej przez delikatne rozcieranie. Powinno być około 15 ml zawiesiny komórek.
6. Dodaj 25 ml pożywki esWash do probówki, aby uzyskać całkowitą objętość do 40 ml. Pozwól, aby duże kawałki podajnika osiadły na dnie rurki przez 1-2 minuty. Usunąć supernatant (~38 ml) z probówki za pomocą pipety serologicznej i umieścić w nowej stożkowej probówce o pojemności 50 ml.
7. Wirować przez 5 minut przy 190 x g. Usunąć supernatant z probówki za pomocą szklanej pipety i odkurzyć. Uważaj, aby nie naruszyć osadu komórkowego. Ponownie zawiesić komórki w 500 μl 1x PBS. Połączyć z przygotowanym wcześniej roztworem do transfekcji plazmidu. Policz komórki na tym etapie. Użyj 5-10 milionów ogniw na elektroporację.
8. Całą zawiesinę o objętości 800 μl należy odpipetować do kuwety elektroporacyjnej o średnicy 4 mm, umieścić na lodzie na 3-5 minut. Elektroporować ogniwa za pomocą programu wykładniczego w systemie elektroporacji o następujących parametrach: 250 V, 500 μF, rezystancja ∞ i rozmiar kuwety 4 mm. Po elektroporacji umieść kuwetę z powrotem na lodzie na 3 min.
   nuta: Przestrzegać stałej czasowej elektroporacji w systemie elektroporacji. Stała czasowa zmienia się w zależności od liczby komórek i czystości DNA. Udane transfekcje zwykle mają stałą czasową między 10-14 ms przy użyciu wymienionych warunków i pulsera genu II. Niższe sprawności elektroporacji mogą wystąpić, gdy stałe czasowe różnią się od tych wartości.
9. Zawiesić elektroporowane ogniwa w 18 ml ciepłych pożywkach hESC uzupełnionych 10 μM Y-27632. Umieścić 3 ml tej zawiesiny jednokomórkowej w każdym dołku płytki 6-dołkowej z komórkami zasilającymi DR4. Wrócić do inkubatora (37 °C/5% CO₂ / 3% O₂).

3. Wybór pozytywnych kolonii

1. Dzień 2, usuń wszystkie media za pomocą szklanej pipety i odkurz. Zastąp 3 ml ciepłych pożywek hESC uzupełnionych 10 μM Y-27632. Dzień 3, usuń wszystkie media za pomocą szklanej pipety i odkurz. Zastąp 3 ml ciepłej pożywki z ludzkimi aktywnymi komórkami macierzystymi bez dołączania Y-27632. Dzień 4, usuń wszystkie media za pomocą szklanej pipety i odkurz. Zastąp 3 ml ciepłych pożywek hESC uzupełnionych antybiotykami do selekcji. Powrót do inkubatora (37 °C/5% CO₂ / 3% O₂).
   nuta: Rodzaj zastosowanego antybiotyku będzie zależał od kasety oporności zawartej w szablonie naprawczym. Podczas pracy z hPSC WIBR#3 (rejestr NIH 0079) z powodzeniem zastosowano 0,5 μg/ml puromycyny, 70 μg/ml G418 (genetycyna) i 35 μg/ml higromycyny. Stężenia do selekcji powinny być określone empirycznie poprzez ustalenie minimalnego stężenia antybiotyku potrzebnego do zabicia komórek typu dzikiego w ciągu około jednego tygodnia.
2. W dniach 5-12 zmieniaj pożywkę codziennie, za każdym razem zastępując starą pożywkę ciepłym pożywką hESC uzupełnioną antybiotykami.
   nuta: Spodziewaj się dużej ilości śmierci komórki. Poszczególne kolonie pojawią się około 8-10 dnia. Zwykłe pożywki z hESC bez antybiotyków można stosować po 12-14 dniach ciągłej selekcji. Jeśli gęstość komórek jest wysoka lub śmierć komórek jest powolna, należy unikać zakwaszania pożywki i może być konieczne zwiększenie objętości pożywki (do 4-5 ml) w ciągu pierwszych kilku dni selekcji.

Rysunek 1. Schemat locus AAVS1 z edytowanym genem przy użyciu szablonu naprawczego AAV-CAGGS-EGFP. Zmodyfikowane na podstawie Hockemeyer et al., 2009.