$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Przygotuj komórki macierzyste do edycji
- Hodować i hodować ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste (hPSC) na 6-dołkowej płytce zawierającej 2,4 × 106 komórek/płytkę inaktywowanych przez mitomycynę C-inaktywowanych mysich fibroblastów zarodkowych (MEF) hodowanych na żelatynie. Utrzymać hPSC w 3 ml pożywki z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych na studzienkę (pożywka hESC) i hodować w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 3% O2/5% CO2,
nuta: Aby ten protokół był skuteczny, nie jest konieczne utrzymywanie hPSC w inkubatorze o niskiej zawartości tlenu; jednak ważne jest, aby pamiętać, że hPSC namnażają się szybciej w środowisku o wysokim poziomieO2, więc czas i liczba komórek powinny być odpowiednio dostosowane. Należy również zauważyć, że hPSC utrzymywane w niskiej zawartości tlenu mają niższe wskaźniki spontanicznego różnicowania.
- Aby przygotować 500 ml pożywki hESC, połącz 380 ml DMEM/F12, 75 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 25 ml zamiennika surowicy nokautującej (KSR). Dodaj glutaminę (1 mM stężenie końcowe), 5 ml 100x aminokwasy endogenne, 100 jednostek/ml penicyliny-streptomycyny (P/S), zasadowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF) (stężenie końcowe 4 ng/ml) i 2-merkaptoetanol (stężenie końcowe 5,5 μM).
- Zmień pożywkę, usuwając całą objętość pożywki (3 ml) za pomocą szklanej pipety i odkurzyć. Zastąp 3 ml ciepłym pożywką hESC za pomocą pipety serologicznej. Powtarzaj zmianę pożywki codziennie, aż hPSC osiągną około 50% zlewu (dzień-1).
- Na dzień przed celowaniem (Dzień-1) zmień pożywkę hESC, usuwając starą pożywkę i dodając ciepłą pożywkę hESC uzupełnioną 10 μM Y-27632.
- Również w dniu -1 przygotuj jedną lub dwie 6-dołkowe lub 10-centymetrowe płytki lekoopornych komórek zasilających MEF od myszy DR4 (2,4 × 106 komórek/płytkę).
Uwaga: Ogólnie rzecz biorąc, płytki 6-dołkowe są lepsze niż płytki 10 cm, ponieważ mieszczą więcej pożywki. Płytki 6-dołkowe zapewniają również, że różne klony z różnych studni są niezależne. Jednak płytka o średnicy 10 cm pozwoli na łatwiejsze zbieranie, w zależności od mikroskopu dostępnego do tego procesu.
2. Edycja pluripotencjalnych komórek macierzystych
- Przygotować roztwory do transfekcji, pipetując po 5 μg ZFN 1 i 2 (ryc. 1) do probówki o pojemności 1,5 ml. Odpipetować 30 μg plazmidu naprawczego również do tej probówki. Na koniec odpipetować 1x sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) do probówki, aby zwiększyć objętość do 300 μl.
nuta: Przygotować plazmidy jako midiprep (odpowiedni jest dowolny zestaw) o minimalnym stężeniu 300 ng/μl, aby utrzymać całkowitą objętość roztworu transfekcji poniżej 300 μl. Nie jest konieczne przeprowadzanie ekstrakcji fenolu/chloroformu, linearyzacja plazmidu ani stosowanie zestawu do przygotowania plazmidu wolnego od endotoksyn.
- Usuń pożywkę z hPSC za pomocą szklanej pipety i odkurz. Odpipetować 2 ml ciepłej 1x PBS do każdej studzienki, aby umyć komórki.
- Natychmiast wyjmij PBS za pomocą szklanej pipety i odkurz. Dodaj 0,5 ml 0,25% roztworu trypsyny-EDTA bezpośrednio na komórki w każdym dołku. Umieścić w inkubatorze (37 °C/5% CO2 / 3% O2) na około 10 minut lub do momentu, gdy warstwa podajnika zacznie odnosić się od płytki.
- Dodaj 2 ml ciepłej pożywki esWash (470 ml DMEM/F12, 25 ml FBS, 100 jednostek/ml P/S) do każdej studzienki, aby zatrzymać reakcję trypsyny.
- Upewnij się, że komórki podajnika są zdejmowane jako arkusz. Odpipetować zawartość każdej studzienki do jednej stożkowej probówki o pojemności 50 ml, łącząc wszystkie studzienki. Roztrzeć komórki za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml. Nie ma potrzeby rozbijania warstwy zasilającej; hPSC odpadną z warstwy zasilającej przez delikatne rozcieranie. Powinno być około 15 ml zawiesiny komórek.
- Dodaj 25 ml pożywki esWash do probówki, aby uzyskać całkowitą objętość do 40 ml. Pozwól, aby duże kawałki podajnika osiadły na dnie rurki przez 1-2 minuty. Usunąć supernatant (~38 ml) z probówki za pomocą pipety serologicznej i umieścić w nowej stożkowej probówce o pojemności 50 ml.
- Wirować przez 5 minut przy 190 x g. Usunąć supernatant z probówki za pomocą szklanej pipety i odkurzyć. Uważaj, aby nie naruszyć osadu komórkowego. Ponownie zawiesić komórki w 500 μl 1x PBS. Połączyć z przygotowanym wcześniej roztworem do transfekcji plazmidu. Policz komórki na tym etapie. Użyj 5-10 milionów ogniw na elektroporację.
- Całą zawiesinę o objętości 800 μl należy odpipetować do kuwety elektroporacyjnej o średnicy 4 mm, umieścić na lodzie na 3-5 minut. Elektroporować ogniwa za pomocą programu wykładniczego w systemie elektroporacji o następujących parametrach: 250 V, 500 μF, rezystancja ∞ i rozmiar kuwety 4 mm. Po elektroporacji umieść kuwetę z powrotem na lodzie na 3 min.
nuta: Przestrzegać stałej czasowej elektroporacji w systemie elektroporacji. Stała czasowa zmienia się w zależności od liczby komórek i czystości DNA. Udane transfekcje zwykle mają stałą czasową między 10-14 ms przy użyciu wymienionych warunków i pulsera genu II. Niższe sprawności elektroporacji mogą wystąpić, gdy stałe czasowe różnią się od tych wartości.
- Zawiesić elektroporowane ogniwa w 18 ml ciepłych pożywkach hESC uzupełnionych 10 μM Y-27632. Umieścić 3 ml tej zawiesiny jednokomórkowej w każdym dołku płytki 6-dołkowej z komórkami zasilającymi DR4. Wrócić do inkubatora (37 °C/5% CO2 / 3% O2).
3. Wybór pozytywnych kolonii
- Dzień 2, usuń wszystkie media za pomocą szklanej pipety i odkurz. Zastąp 3 ml ciepłych pożywek hESC uzupełnionych 10 μM Y-27632. Dzień 3, usuń wszystkie media za pomocą szklanej pipety i odkurz. Zastąp 3 ml ciepłej pożywki z ludzkimi aktywnymi komórkami macierzystymi bez dołączania Y-27632. Dzień 4, usuń wszystkie media za pomocą szklanej pipety i odkurz. Zastąp 3 ml ciepłych pożywek hESC uzupełnionych antybiotykami do selekcji. Powrót do inkubatora (37 °C/5% CO2 / 3% O2).
nuta: Rodzaj zastosowanego antybiotyku będzie zależał od kasety oporności zawartej w szablonie naprawczym. Podczas pracy z hPSC WIBR#3 (rejestr NIH 0079) z powodzeniem zastosowano 0,5 μg/ml puromycyny, 70 μg/ml G418 (genetycyna) i 35 μg/ml higromycyny. Stężenia do selekcji powinny być określone empirycznie poprzez ustalenie minimalnego stężenia antybiotyku potrzebnego do zabicia komórek typu dzikiego w ciągu około jednego tygodnia.
- W dniach 5-12 zmieniaj pożywkę codziennie, za każdym razem zastępując starą pożywkę ciepłym pożywką hESC uzupełnioną antybiotykami.
nuta: Spodziewaj się dużej ilości śmierci komórki. Poszczególne kolonie pojawią się około 8-10 dnia. Zwykłe pożywki z hESC bez antybiotyków można stosować po 12-14 dniach ciągłej selekcji. Jeśli gęstość komórek jest wysoka lub śmierć komórek jest powolna, należy unikać zakwaszania pożywki i może być konieczne zwiększenie objętości pożywki (do 4-5 ml) w ciągu pierwszych kilku dni selekcji.
