1. Przygotowanie matrycy membrany podstawowej i powlekanie wyrobów z tworzyw sztucznych
- Zamrożony materiał z matrycą błony podstawnej umieścić w temperaturze od -20 °C do lodu i rozmrozić przez noc w temperaturze 4 °C.
- Po rozmrożeniu odpipetować 2 mg podwielokrotności macierzy błony podstawnej do wstępnie schłodzonych probówek Eppendorfa. Przechowuj je w temperaturze -20 °C do czasu, gdy będą potrzebne.
- Aby przygotować płytki pokryte matrycą membrany podstawnej, rozmrozić jedną porcję na lodzie, aż ostatni kawałek lodu w probówce eppendorfa zniknie (zwykle w ciągu ~2 godzin).
- Po rozmrożeniu dodać matrycę błony podstawnej do 12 ml zimnego (4 °C) DMEM/F12, aby uzyskać roztwór do powlekania matrycy membrany podstawnej.
- Dodać roztwór macierzy błony podstawnej do odpowiedniego naczynia hodowlanego. W przypadku płytki 6-dołkowej należy dozować 1 ml na dołek. Zakręć płytą, aby upewnić się, że roztwór matrycy membrany podstawnej całkowicie zakrywa każdą studzienkę.
- Parafilm uszczelnić płytę/naczynie pokryte matrycą membrany podstawnej i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę przed użyciem. Alternatywnie, płyty/naczynia pokryte membraną podstawną należy przechowywać w temperaturze 4 °C i zużyć w ciągu 2 tygodni od nałożenia powłoki.
nuta: Dodaj dodatkowy DMEM/F12 do płyty/naczynia pokrytego matrycą membrany podstawnej, aby zapobiec wysuszeniu. Przed użyciem płyty/naczynia pokrytego membraną podstawową o temperaturze 4 °C należy umieścić je w komorze bezpieczeństwa biologicznego i pozostawić do osiągnięcia temperatury pokojowej na co najmniej 30 minut.
- Całkowicie odessać matrycę błony podstawnej przed dodaniem pożywki i komórek.
2. Przygotowanie podłoża E8
- Przygotować pożywkę E8, rozmrażając suplement E8 przez noc w temperaturze 4 °C.
- Usunąć 10 ml podłoża podstawowego E8 z 500 ml bulionu i wyrzucić.
- Odpipetować całą 10 ml fiolkę z suplementem E8 bezpośrednio do 490 ml podłoża podstawowego E8. Nie podgrzewać kompletnego podłoża E8 w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, ponieważ powtarzające się wahania temperatury mogą spowodować degradację bFGF w całym podłożu E8.
- Zużyć kompletną pożywkę E8 w ciągu 2 tygodni od dodania suplementu.
3. Rozmrażanie iPSC
- Wyjąć fiolkę z zamrożonymi iPSC z ciekłego azotu i umieścić na suchym lodzie.
- Szybko rozmrozić fiolkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C; obracać fiolkę w łaźni wodnej do momentu, aż pozostanie tylko niewielki fragment lodu.
- Spryskać fiolkę 70% etanolem i przenieść do komory bezpieczeństwa biologicznego.
- Dodać kroplami 1 ml pożywki E8 o temperaturze pokojowej bezpośrednio do fiolki.
- Za pomocą pipety o pojemności 2 ml przenieść zawiesinę komórek kroplami do 9 ml pożywki E8 w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Często obracaj probówką, aby upewnić się, że komórki i podłoże dobrze się mieszają.
- Odwirować komórki przy 200 x g przez 5 minut.
- Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w odpowiedniej objętości E8 uzupełnionej 10 μM Y-27632.
- Dodać komórki do odpowiedniej liczby studzienek pokrytych matrycą membrany podstawnej i umieścić na noc w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO₂. Zaleca się płytki z co najmniej 0,2 x 10⁶ iPSC na dołek płytki 6-dołkowej, aby umożliwić szybkie odzyskanie po rozmrożeniu.
4. Konserwacja i rutynowe przechodzenie iPSC
- Odświeżaj pożywkę E8 codziennie.
- Monitoruj morfologię i zbieganie się komórek za pomocą odwróconego mikroskopu. Wysokiej jakości iPSC rosną w płaskich koloniach z wyraźnymi granicami; poszczególne rodziny mają wygląd przypominający kostkę brukową.
- Przejście komórek iPSC, gdy osiągną ~70% konfluencji.
- Przygotować roztwór pasażujący EDTA, dodając 0,9 g NaCl i 500 μl 0,5 M EDTA do 500 ml DPBS. Dobrze wymieszaj, aby rozpuścić NaCl i filtr próżniowy do sterylizacji. Przed pasażowaniem ogrzać porcję roztworu pasażującego w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
- Aby przejść, odessać zużytą pożywkę hodowlaną i przemyć komórki raz równą objętością ciepłego roztworu pasażowego. Aspirat i odpipetować wystarczającą ilość roztworu pasującego EDTA, aby pokryć komórki (1 ml na dołek płytki 6-dołkowej).
- Umieść komórki pod odwróconym mikroskopem i obserwuj kolonie iPSC. Pojawienie się w koloniach i podniesionych granicach powinno stać się widoczne w ciągu 2 do 5 minut.
- Ostrożnie zassać roztwór pasażujący EDTA.
- Za pomocą pipety o pojemności 10 ml dozować 4 ml pożywki E8 (w przypadku użycia płytki 6-dołkowej) pod wysokim ciśnieniem bezpośrednio do każdej studzienki, która ma być przepuszczona.
- Zbierz grudki iPSC i podziel je na odpowiednią liczbę dołków w zależności od proporcji podziału od 1:8 do 1:12. Nie należy pipetować zbyt mocno, ponieważ dezagregacja grudek komórek spowoduje słabą żywotność.
- Umieść płytkę w inkubatorze i kilkakrotnie kołysz płytką w przód iw tył oraz na boki, aby rozproszyć komórki.
5. Przygotowanie MEFów i iPSC do transfekcji
- 48 godzin przed transfekcją należy przepuścić iPSC w temperaturze ~ 1:6 do czterech lub więcej studzienek 6-dołkowej płytki pokrytej matrycą membrany podstawnej, tak aby za dwa dni były one w 70% zlewane.
- Następnego dnia rozmrozić DR4 MEF do pożywki MEF składającej się z DMEM (wysoki poziom glukozy) uzupełnionego 10% FBS i 1x MEM-NEAA.
- Umieścić DR4 MEF na dwóch 10-centymetrowych szalkach w temperaturze ~ 2 x 10⁴ komórek/cm² i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
- W dniu transfekcji należy zmienić pożywkę MEF na E8 uzupełnioną 10 μM Y-27632 30 minut przed wykonaniem transfekcji na iPSC.
- Opcjonalnie: 4 godziny przed transfekcją uzupełnij hodowlę iPSC przed transfekcją Y-27632 w końcowym stężeniu 10 μM.
6. Odczynnik dysocjacji komórek delikatnych Leczenie i transfekcja iPSC za pomocą systemu elektroporacji
- Usunąć roztwór do transfekcji komórek pierwotnych P3 z 4 °C i pozostawić do osiągnięcia temperatury pokojowej na ~30 minut. Przed użyciem dodać cały 100 μl suplementu do roztworu do transfekcji.
- Ciepły odczynnik do dysocjacji delikatnych komórek w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
- Uzyskać TALENY AAVS1 (pZT-AAVS1-L1 i pZT-AAVS1-R1) oraz dawcę AAVS1-CAG-EGFP od -20 °C.
- Wyjąć iPSC z inkubatora i przemyć je raz za pomocą DPBS.
- Dodać 1 ml odczynnika do dysocjacji delikatnych komórek do dołka i inkubować iPSC w temperaturze 37 °C przez 5 minut lub do momentu, gdy więcej niż 50% komórek oddzieli się od naczynia hodowlanego.
- Odpipetuj komórki kilka razy w górę i w dół za pomocą pipety p1000, aby oddzielić wszelkie pozostałe komórki od naczynia hodowlanego i rozbić grudki iPSC.
- Dodać 2 ml pożywki E8 do każdej studzienki i kilkakrotnie pipetować w górę i w dół za pomocą pipety o pojemności 10 ml, aby dalej dezagregować grudki komórek na pojedyncze komórki.
nuta: Skuteczność transfekcji znacznie spada, jeśli grudki komórek nie są wystarczająco zdezagregowane.
- Zebrać iPSC do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 100 x g przez 3 minuty.
- Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w minimalnej ilości pożywki E8.
- Policz komórki za pomocą hemocytometru po nałożeniu ważnego barwnika, takiego jak 0,4% błękitu trypanowego. Upewnij się, że komórki są wystarczająco zdysocjowane podczas liczenia (1-3 komórki na "kępę").
- Dozować 3 x 10⁶ komórki do każdej z dwóch stożkowych probówek o pojemności 15 ml i ponownie odwirowywać przy 100 x g przez 3 min.
nuta: Wirowanie przy niskiej prędkości zmniejsza obciążenie komórek i umożliwia łatwe ponowne zawieszenie iPSC przed elektroporacją.
- Ustawić system elektroporacji na program specyficzny dla typu komórki dla linii ludzkich embrionalnych komórek macierzystych H9 (Program CB-150).
- Po odwirowaniu odessać supernatant z osadów komórkowych. Do jednej osadki dodać 10 μg dawcy HR jako próbkę kontrolną. Do drugiego osadu dodać 10 μg dawcy HR wraz z 5 μg każdego TALEN-a (pZT-AAVS1-L1 i pZT-AAVS1-R1) jako próbkę doświadczalną.
- Zawiesić każdą osadkę komórkową w 100 μl roztworu do transfekcji komórek pierwotnych P3 i przenieść do kuwety.
- Wykonaj transfekcję i natychmiast dodaj 500 μl pożywki E8 o temperaturze pokojowej do każdej kuwety.
- Przenieść transfekowane iPSC kroplami do jednej 10-centymetrowej płytki zawierającej MEF DR4 przygotowane w kroku 5.4.
