Ukierunkowana integracja genów za pośrednictwem TALEN: wykorzystanie zmodyfikowanych nukleaz specyficznych dla sekwencji do precyzyjnej insercji genu białka fluorescencyjnego do hiPSC

Abstract

Źródło: Cerbini, T. et al. Transfekcja, selekcja i zbieranie kolonii ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych TALEN-ukierunkowanych na gen GFP do AAVS1 Safe Harbor. J. Vis. Exp. (2015)

Ten film opisuje precyzyjną technikę edycji genomu w ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórkach macierzystych (hiPSC), wykorzystującą TALENy do tworzenia dwuniciowych pęknięć w docelowym locus, indukując ukierunkowaną homologię naprawę integracji genów białka fluorescencji.

Protocol

1. Przygotowanie matrycy membrany podstawowej i powlekanie wyrobów z tworzyw sztucznych

1. Zamrożony materiał z matrycą błony podstawnej umieścić w temperaturze od -20 °C do lodu i rozmrozić przez noc w temperaturze 4 °C.
2. Po rozmrożeniu odpipetować 2 mg podwielokrotności macierzy błony podstawnej do wstępnie schłodzonych probówek Eppendorfa. Przechowuj je w temperaturze -20 °C do czasu, gdy będą potrzebne.
3. Aby przygotować płytki pokryte matrycą membrany podstawnej, rozmrozić jedną porcję na lodzie, aż ostatni kawałek lodu w probówce eppendorfa zniknie (zwykle w ciągu ~2 godzin).
4. Po rozmrożeniu dodać matrycę błony podstawnej do 12 ml zimnego (4 °C) DMEM/F12, aby uzyskać roztwór do powlekania matrycy membrany podstawnej.
5. Dodać roztwór macierzy błony podstawnej do odpowiedniego naczynia hodowlanego. W przypadku płytki 6-dołkowej należy dozować 1 ml na dołek. Zakręć płytą, aby upewnić się, że roztwór matrycy membrany podstawnej całkowicie zakrywa każdą studzienkę.
6. Parafilm uszczelnić płytę/naczynie pokryte matrycą membrany podstawnej i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę przed użyciem. Alternatywnie, płyty/naczynia pokryte membraną podstawną należy przechowywać w temperaturze 4 °C i zużyć w ciągu 2 tygodni od nałożenia powłoki.
   nuta: Dodaj dodatkowy DMEM/F12 do płyty/naczynia pokrytego matrycą membrany podstawnej, aby zapobiec wysuszeniu. Przed użyciem płyty/naczynia pokrytego membraną podstawową o temperaturze 4 °C należy umieścić je w komorze bezpieczeństwa biologicznego i pozostawić do osiągnięcia temperatury pokojowej na co najmniej 30 minut.
7. Całkowicie odessać matrycę błony podstawnej przed dodaniem pożywki i komórek.

2. Przygotowanie podłoża E8

1. Przygotować pożywkę E8, rozmrażając suplement E8 przez noc w temperaturze 4 °C.
2. Usunąć 10 ml podłoża podstawowego E8 z 500 ml bulionu i wyrzucić.
3. Odpipetować całą 10 ml fiolkę z suplementem E8 bezpośrednio do 490 ml podłoża podstawowego E8. Nie podgrzewać kompletnego podłoża E8 w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, ponieważ powtarzające się wahania temperatury mogą spowodować degradację bFGF w całym podłożu E8.
4. Zużyć kompletną pożywkę E8 w ciągu 2 tygodni od dodania suplementu.

3. Rozmrażanie iPSC

1. Wyjąć fiolkę z zamrożonymi iPSC z ciekłego azotu i umieścić na suchym lodzie.
2. Szybko rozmrozić fiolkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C; obracać fiolkę w łaźni wodnej do momentu, aż pozostanie tylko niewielki fragment lodu.
3. Spryskać fiolkę 70% etanolem i przenieść do komory bezpieczeństwa biologicznego.
4. Dodać kroplami 1 ml pożywki E8 o temperaturze pokojowej bezpośrednio do fiolki.
5. Za pomocą pipety o pojemności 2 ml przenieść zawiesinę komórek kroplami do 9 ml pożywki E8 w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Często obracaj probówką, aby upewnić się, że komórki i podłoże dobrze się mieszają.
6. Odwirować komórki przy 200 x g przez 5 minut.
7. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w odpowiedniej objętości E8 uzupełnionej 10 μM Y-27632.
8. Dodać komórki do odpowiedniej liczby studzienek pokrytych matrycą membrany podstawnej i umieścić na noc w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO₂. Zaleca się płytki z co najmniej 0,2 x 10⁶ iPSC na dołek płytki 6-dołkowej, aby umożliwić szybkie odzyskanie po rozmrożeniu.

4. Konserwacja i rutynowe przechodzenie iPSC

1. Odświeżaj pożywkę E8 codziennie.
2. Monitoruj morfologię i zbieganie się komórek za pomocą odwróconego mikroskopu. Wysokiej jakości iPSC rosną w płaskich koloniach z wyraźnymi granicami; poszczególne rodziny mają wygląd przypominający kostkę brukową.
3. Przejście komórek iPSC, gdy osiągną ~70% konfluencji.
4. Przygotować roztwór pasażujący EDTA, dodając 0,9 g NaCl i 500 μl 0,5 M EDTA do 500 ml DPBS. Dobrze wymieszaj, aby rozpuścić NaCl i filtr próżniowy do sterylizacji. Przed pasażowaniem ogrzać porcję roztworu pasażującego w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
5. Aby przejść, odessać zużytą pożywkę hodowlaną i przemyć komórki raz równą objętością ciepłego roztworu pasażowego. Aspirat i odpipetować wystarczającą ilość roztworu pasującego EDTA, aby pokryć komórki (1 ml na dołek płytki 6-dołkowej).
6. Umieść komórki pod odwróconym mikroskopem i obserwuj kolonie iPSC. Pojawienie się w koloniach i podniesionych granicach powinno stać się widoczne w ciągu 2 do 5 minut.
7. Ostrożnie zassać roztwór pasażujący EDTA.
8. Za pomocą pipety o pojemności 10 ml dozować 4 ml pożywki E8 (w przypadku użycia płytki 6-dołkowej) pod wysokim ciśnieniem bezpośrednio do każdej studzienki, która ma być przepuszczona.
9. Zbierz grudki iPSC i podziel je na odpowiednią liczbę dołków w zależności od proporcji podziału od 1:8 do 1:12. Nie należy pipetować zbyt mocno, ponieważ dezagregacja grudek komórek spowoduje słabą żywotność.
10. Umieść płytkę w inkubatorze i kilkakrotnie kołysz płytką w przód iw tył oraz na boki, aby rozproszyć komórki.

5. Przygotowanie MEFów i iPSC do transfekcji

1. 48 godzin przed transfekcją należy przepuścić iPSC w temperaturze ~ 1:6 do czterech lub więcej studzienek 6-dołkowej płytki pokrytej matrycą membrany podstawnej, tak aby za dwa dni były one w 70% zlewane.
2. Następnego dnia rozmrozić DR4 MEF do pożywki MEF składającej się z DMEM (wysoki poziom glukozy) uzupełnionego 10% FBS i 1x MEM-NEAA.
3. Umieścić DR4 MEF na dwóch 10-centymetrowych szalkach w temperaturze ~ 2 x 10⁴ komórek/cm² i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
4. W dniu transfekcji należy zmienić pożywkę MEF na E8 uzupełnioną 10 μM Y-27632 30 minut przed wykonaniem transfekcji na iPSC.
5. Opcjonalnie: 4 godziny przed transfekcją uzupełnij hodowlę iPSC przed transfekcją Y-27632 w końcowym stężeniu 10 μM.

6. Odczynnik dysocjacji komórek delikatnych Leczenie i transfekcja iPSC za pomocą systemu elektroporacji

1. Usunąć roztwór do transfekcji komórek pierwotnych P3 z 4 °C i pozostawić do osiągnięcia temperatury pokojowej na ~30 minut. Przed użyciem dodać cały 100 μl suplementu do roztworu do transfekcji.
2. Ciepły odczynnik do dysocjacji delikatnych komórek w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
3. Uzyskać TALENY AAVS1 (pZT-AAVS1-L1 i pZT-AAVS1-R1) oraz dawcę AAVS1-CAG-EGFP od -20 °C.
4. Wyjąć iPSC z inkubatora i przemyć je raz za pomocą DPBS.
5. Dodać 1 ml odczynnika do dysocjacji delikatnych komórek do dołka i inkubować iPSC w temperaturze 37 °C przez 5 minut lub do momentu, gdy więcej niż 50% komórek oddzieli się od naczynia hodowlanego.
6. Odpipetuj komórki kilka razy w górę i w dół za pomocą pipety p1000, aby oddzielić wszelkie pozostałe komórki od naczynia hodowlanego i rozbić grudki iPSC.
7. Dodać 2 ml pożywki E8 do każdej studzienki i kilkakrotnie pipetować w górę i w dół za pomocą pipety o pojemności 10 ml, aby dalej dezagregować grudki komórek na pojedyncze komórki.
   nuta: Skuteczność transfekcji znacznie spada, jeśli grudki komórek nie są wystarczająco zdezagregowane.
8. Zebrać iPSC do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 100 x g przez 3 minuty.
9. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w minimalnej ilości pożywki E8.
10. Policz komórki za pomocą hemocytometru po nałożeniu ważnego barwnika, takiego jak 0,4% błękitu trypanowego. Upewnij się, że komórki są wystarczająco zdysocjowane podczas liczenia (1-3 komórki na "kępę").
11. Dozować 3 x 10⁶ komórki do każdej z dwóch stożkowych probówek o pojemności 15 ml i ponownie odwirowywać przy 100 x g przez 3 min.
    nuta: Wirowanie przy niskiej prędkości zmniejsza obciążenie komórek i umożliwia łatwe ponowne zawieszenie iPSC przed elektroporacją.
12. Ustawić system elektroporacji na program specyficzny dla typu komórki dla linii ludzkich embrionalnych komórek macierzystych H9 (Program CB-150).
13. Po odwirowaniu odessać supernatant z osadów komórkowych. Do jednej osadki dodać 10 μg dawcy HR jako próbkę kontrolną. Do drugiego osadu dodać 10 μg dawcy HR wraz z 5 μg każdego TALEN-a (pZT-AAVS1-L1 i pZT-AAVS1-R1) jako próbkę doświadczalną.
14. Zawiesić każdą osadkę komórkową w 100 μl roztworu do transfekcji komórek pierwotnych P3 i przenieść do kuwety.
15. Wykonaj transfekcję i natychmiast dodaj 500 μl pożywki E8 o temperaturze pokojowej do każdej kuwety.
16. Przenieść transfekowane iPSC kroplami do jednej 10-centymetrowej płytki zawierającej MEF DR4 przygotowane w kroku 5.4.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Matrigel Matryca błony podstawnej o zredukowanym czynniku wzrostu (GFR), *bez LDEV, 10 ml	Corning	Numer telefonu 354230	Przechowywać w temperaturze -20 °C.
DMEM/F-12	Technologie życiowe	Numer katalogowy: 11320-033	Przechowywać w temperaturze 4 °C.
Costar 6 Well Clear Płytki wielodołkowe poddane działaniu TC	Corning	Numer katalogowy: 3506
Podstawowy 8 Średni	Technologie życiowe	A1517001	Przechowywać podłoże podstawowe w temperaturze 4 °C. Suplement przechowywać w temperaturze -20 °C.
Dichlorowodorek Y-27632	Tocris powiedział:	1254	Przechowywać w temp. pokojowej. Po rozpuszczeniu wH2Oprzechowywać w temperaturze -20 °C.
chlorek sodu	Sigma	S5886-500G
UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0	Technologie życiowe	Numer katalogowy 15575-020
DPBS, bez wapnia, bez magnezu	Technologie życiowe	Nr kat. 14190-250
Naczynie hodowlane 100 mm z powłoką TC	Corning	430167
DR4 MEF 2M IRR - Akademickie	Globalny Stem	GSC-6204G	Przechowywać w ciekłym azocie.
DMEM, wysoka glukoza, pirogronian	Technologie życiowe	Numer katalogowy 11995-040	Przechowywać w temperaturze 4 °C.
Zdefiniowana płodowa surowica bydlęca, pochodzenie amerykańskie	Klon HyClone	SH30070.03	Przechowywać w temperaturze -20 °C. Rozmrażać w temperaturze 4 °C przez noc i podwielokrotnie. Przechowywać porcje w temperaturze -20 °C do czasu, gdy będą potrzebne.
Roztwór aminokwasów endogennych MEM (100X)	Technologie życiowe	Numer katalogowy: 11140-050	Przechowywać w temperaturze 4 °C.
Jednostka podstawowa 4D-Nucleofector	Lonza	AAF-1001B	Część systemu elektroporacji.
Jednostka 4D-Nucleofector X	Lonza	AAF-1001X	Część systemu elektroporacji.
P3 Komórka pierwotna 4D-Nucleofector X Zestaw L (24 RCT)	Lonza	V4XP-3024	Po przybyciu należy usunąć roztwór komórek pierwotnych, uzupełnić i przechowywać w temperaturze 4 °C.
StemPro Accutase Odczynnik do dysocjacji komórek	Technologie życiowe	A1110501	Przechowywać w temperaturze -20 °C. Rozmrozić przez noc w temperaturze 4°C i przed użyciem ogrzać porcję w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
Pożywka hodowlana NutriStem XF/FF	Stemgent (Łodyga	01-2005	Przechowywać w temperaturze -20 °C. Rozmrozić przez noc w temperaturze 4 °C
TALENY AAVS1 (pZT-AAVS1-L1 i pZT-AAVS1-R1)	Addgene powiedział:	52637 oraz 52638
AAVS1-CAG-EGFP Dawca rekombinacji homologicznej	Addgene powiedział:	Numer katalogowy: 22212
Dichlorowodorek puromycyny	Technologie życiowe	A11138-03	Przechowywać w temperaturze -20 °C. Przygotować porcje robocze 1 mg/ml w ddH2O.
Jednorazowe pipety Pasteura ze szkła borokrzemianowego	Fisher Naukowy	13-678-20A
Sorvall Legend XTR (Chłodzenie), 120 V 60 Hz	Thermo Scientific	75-004-521
TX-750 4 × 750 ml Wahadłowy wirnik kubełkowy	Thermo Scientific	75003607
Roztwór błękitu trypanowego, 0,4%	Technologie życiowe	Numer katalogowy: 15250-061