phiC31-Integraza-Medi-Site-Directed Transgene Integration: Technika mikroiniekcji do specyficznej dla miejsca integracji transgenu z wektorem Anopheles

1. Przygotowanie plazmidów do mieszanki mikroiniekcyjnej

UWAGA: Przedstawiony tutaj protokół obejmuje użycie dwóch plazmidów: plazmidu dawcy oznaczonego attB (miejsce przyłączenia pochodzące od bakterii gospodarza) przenoszącego interesujący nas transgen oraz plazmidu pomocniczego, który wyraża integrazę φC31 pod kontrolą promotora Drosophila Hsp70.

1. Oczyść plazmidy dawcy i pomocnika za pomocą zestawu do oczyszczania plazmidu bez endotoksyn.
   nuta: Sekwencjonować końcowy preparat plazmidowy używany do wstrzykiwań, aby sprawdzić integralność wszystkich składników.
2. Połączyć odpowiednie ilości dwóch plazmidów, aby otrzymać mieszaninę o końcowym stężeniu 350 ng/μl plazmidu dawcy i 150 ng/μl plazmidu pomocniczego po ponownym zawieszeniu w buforze do wstrzykiwań.
   nuta: Obliczając niezbędną objętość mieszanki, należy wziąć pod uwagę, że 10-15 μl wystarcza na każdy dzień planowanych wstrzyknięć, a DNA można przygotować z wyprzedzeniem i przechowywać w temperaturze -20 °C. Zgłoszono również stężenia plazmidu pomocniczego integrazy wynoszące 60-500 ng/μl i stężenia plazmidu dawcy wynoszące 85-200 ng/μl.
3. Wytrącić DNA, dodając 0,1 objętości 3 M octanu sodu (pH 5,2) i 2,5 objętości lodowatego 100% EtOH i wiru. Biały osad powinien być natychmiast widoczny. Posiadanie wysoce skoncentrowanych początkowych preparatów plazmidowych (tj. ~1 μg/μL) poprawia efektywność wytrącania.
   nuta: Punkt zatrzymania - Osad może być przechowywany w temperaturze -20 °C przez noc.
4. Wirować przy 15 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C, wyrzucić supernatant i przemyć osad 1 ml lodowatego 70% EtOH.
5. Umyj granulat 1 ml lodowatego 70% EtOH i odwiruj przy 15 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
6. Odrzucić supernatant bez naruszania osadu i wysuszyć na powietrzu.
7. Zawiesić osad w 1x buforze iniekcyjnym (0,1 mM Na₃PO₄, 5 mM KCl, pH 7,2, filtr 0,22 μm wysterylizowany), aby osiągnąć całkowite stężenie końcowe 500 ng / μL.
   nuta: Załóżmy, że część DNA zostanie utracona podczas procesu wytrącania; dlatego najpierw należy dodać mniejszą objętość buforu do wstrzykiwań, sprawdzić stężenie na spektrofotometrze (np. Nanodrop), a następnie dodać odpowiednią pozostałą objętość, aby osiągnąć 500 ng/μL.
8. Upewnić się, że DNA jest dokładnie zawieszone, przygotować porcje po 10-15 μl każdy i przechowywać je w temperaturze -20 °C.
9. W dniu wstrzyknięcia rozmrozić jedną porcję i odwirować przy 15 000 x g przez 5 minut w celu usunięcia wszelkich pozostałości cząstek stałych.
   UWAGA: Alternatywną metodą usuwania cząstek stałych jest przefiltrowanie roztworu przez filtr 0,22 μm. Należy unikać obecności pozostałości cząstek stałych w mieszance iniekcyjnej, ponieważ prowadzą one do zablokowania igły podczas mikroiniekcji zarodka.

2. Mikroiniekcja zarodków z linii dokującej Anopheles

1. Nakarmić krwią 4-7-dniowe komary z pożądanej linii dokowania 72 godziny przed mikroiniekcją (tj. do iniekcji w poniedziałek i wtorek karmić samice w poprzedni piątek; do iniekcji w czwartek i piątek karmić samice w poniedziałek tego samego tygodnia).
2. Tego samego dnia należy karmić krwią komary typu dzikiego (WT) (tj. komary o tym samym tle genomowym linii dokowania); będą one potrzebne do krzyżowania.
   nuta: Wielkość i jakość mączki z krwi wpływa na jakość jaj, dlatego zaleca się, aby zawsze używać świeżej krwi (tj. krwi pobranej w ciągu ostatnich 7 dni). Karmienie ramionami lub karmienie myszy może zwiększyć jakość i ilość jaj, jednak nie zaleca się stosowania tych metod. W przypadku stosowania u ludzi i zwierząt konieczne będą specjalne zatwierdzone protokoły.
3. Wykonywanie mikroiniekcji zarodków
   1. Wykonać mikroiniekcje zarodków An. gambiae w 25 mM NaCl, celując w tylny biegun zarodka pod kątem 45 stopni. Aby uzyskać szczegółowy protokół pobierania zarodków, wyrównania i mikroiniekcji, zapoznaj się z Pondeville i wsp.oraz Lobo i wsp.
   2. Wykonaj mikroiniekcję zarodka An. stephensi w oleju halowęglowym 700:27 (2:1), celując w tylny biegun zarodka pod kątem 30 stopni. Szczegółowy protokół pobierania zarodków, wyrównywania i mikroiniekcji można znaleźć w Terenius et al.oraz Lobo i wsp.
   3. Przenieść jaja natychmiast po wstrzyknięciu na szalkę Petriego wypełnioną sterylną wodą destylowaną (pH 7,2) i przywrócić je do warunków insektowych.
4. Po wykluciu należy codziennie przenosić larwy G₀ do tacy z osoloną wodą destylowaną (0,1% soli tonizującej) i z powrotem do poczwarek.
5. Rekordowy wskaźnik wylęgu (tj. liczba wyklutych larw/liczba wstrzykniętych zarodków).
   nuta: Ruch zarodka wspomaga wykluwanie, dlatego pożądane jest delikatne wirowanie. Wylęg powinien rozpocząć się ~48 h po wstrzyknięciu. Ponieważ wstrzyknięcie może spowodować niewielkie opóźnienie rozwoju, zaleca się monitorowanie późno wylęgających się larw przez 3-4 dni.