$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Definicja protospaceru i budowa plazmidu
UWAGA: W tej sekcji opisano pierwszy krok wyboru odpowiednich protospacerów do budowy sgRNA i dalszej ligacji do pMaOri.dCas9 (Rysunek 1). Ta sekwencja protospacerowa składa się z sekwencji 20 nukleotydów skierowanych przeciwko pożądanemu celowi.
- Uzyskaj sekwencję nukleotydową genu będącego przedmiotem zainteresowania do wyciszenia w GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank). Prześlij go na serwer WWW CHOPCHOP (http://chopchop.cbu.uib.no/), z parametrami zdefiniowanymi dla Streptococcus pyogenes Cas9 i sąsiadującego z nim motywu protospacerowego NGG po wybraniu opcji "Fasta Target". Zdefiniuj parametry na "CRISPR/Cas9" i PAM (protospacer sąsiedni motyw) NGG.
- Na podstawie uzyskanych wyników wybierz protospacery z najlepszym możliwym wynikiem (zielona strzałka), które znajdują się jak najbliżej końca 5' regionu kodującego i, co najważniejsze, są zawarte w nici matrycowej (ujemnej), ponieważ sgRNA musi sparować się z nicią kodującą genu w celu całkowitego wyciszenia genu.
nuta: Motyw NGG nie jest uwzględniony w końcowej sekwencji sgRNA.
- Użyj promotora lipL32 do ekspresji pojedynczego przewodnika RNA, który zawiera zmienną sekwencję nukleotydową 20 na końcu 5' i konserwatywną sekwencję rusztowania dCas9. Połącz sekwencję 20-nt, zwaną protospacerem, z promotorem lipL32 (na końcu 5') i rusztowaniem sgRNA (koniec 3') (Figura 1B).
nuta: Aby uzyskać dobrze zdefiniowany promotor lipL32, użyj regionu promotora składającego się z -334 do TSS (miejsce rozpoczęcia transkrypcji, na podstawie Zhukova i wsp.). Sprawdź w Tabeli 1 ostateczną kasetę sgRNA.
- Wygeneruj kasetę sgRNA metodą sekwencyjnego PCR lub zleć jej syntezę komercyjnemu dostawcy.
- Po otrzymaniu kasety należy ją podwiązać do plazmidu pMaOri.dCas9 w miejscu restrykcji XmaI na obu końcach (cccggg).
- Trawić zarówno kasetę sgRNA, jak i plazmid pMaOri.dCas9 enzymem restrykcyjnym XmaI i przystąpić do ligacji (Figura 1B).
- Wykonaj etapy klonowania w dT auksotroficznym szczepie E. coli π1, ze względu na pochodzenie replikacji pMaOri (a co za tym idzie, pMaOri.dCas9), R6K-gamma.
UWAGA: Aby zapoznać się ze szczegółowym protokołem podwiązania i selekcji klonów, zapoznaj się z poprzednimi publikacjami Fernandesa i Nascimento. Sterowany przez sgRNA dCas9 zwiąże się z nicią kodującą wybranego genu będącego przedmiotem zainteresowania, a zatem będzie blokował wydłużanie polimerazy RNA (Figura 1C), powodując wyciszenie genu.
2. Transformacja Leptospira przez koniugację
UWAGA: Schemat graficzny tego kroku jest przedstawiony na rysunku 2. Aby wykonać nośniki HAN i płyty HAN, zapoznaj się z Hornsby i wsp. oraz Fernandes i wsp.
- Hodować chorobotwórcze komórki Leptospira w temperaturze 29 lub 37 °C w pożywce HAN pod wpływem mieszania, rozcieńczając nasyconą kulturę w świeżym HAN w stosunku 1:100; zazwyczaj L. interrogans serowar Copenhageni szczep Fiocruz L1-130 potrzebuje 4-6 dni, aby osiągnąć odpowiednią gęstość komórek.
- Upewnij się, że kultury osiągną średnicę zewnętrzną 0,2-0,4 przy 420 nm (2 do 5 x 108 komórek/ml) przed użyciem do koniugacji.
nuta: Ponieważ pożywka HAN zmienia kolor wraz ze wzrostem gęstości komórek (z powodu czerwieni fenolowej zawartej w pożywce DMEM), należy odwirować (4 000 x g, 15 min, temperatura pokojowa) 1 ml pożywki hodowlanej w celu usunięcia leptospirów i zastosować supernatant jako ślepą próbę do pomiaru średnicy zewnętrznej.
- Przekształć sprzężony szczep E. coli β2163, auksotroficzny dla kwasu diaminopimelicznego (DAP), z plazmidem pMaOri.dCas9 zawierającym kasetę sgRNA. W przypadku transformacji E. coli należy użyć protokołów szoku cieplnego lub elektroporacji. Uwzględnij transformację z plazmidem pMaOri.dCas9 bez kasety sgRNA jako kontrolę.
- W celu przemiany w wyniku szoku cieplnego należy zmieszać plazmidowe DNA (100 ng) z chemicznie kompetentnymi komórkami E. coli i inkubować na lodzie przez 30 minut. Przeprowadzić szok termiczny w temperaturze 42 °C przez 90 s i ponownie umieścić go na lodzie na 5 minut. Odzyskać komórki, dodając 1 ml pożywki LB, inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę i przejść do posiewu.
- Do elektroporacji użyj elektrokompetentnych komórek zmieszanych ze 100 ng plazmidowego DNA. Użyj następujących parametrów dla impulsu: 1.8 kV, 100 Ω i 25 μF. Odzyskaj ogniwa, jak wyjaśniono powyżej.
- Umieść przekształcone komórki E. coli dawcy w pożywce agarowej LB uzupełnionej kwasem diaminomelicznym (DAP) (0,3 mM) i spektynomycyną (40 μg / ml) w celu wyselekcjonowania plazmidów.
- Do koniugacji wybierz jedną kolonię z każdej płytki na dzień przed dniem koniugacji (który określa się poprzez monitorowanie średnicy zewnętrznej kultur leptospires).
- Wybierz jedną kolonię E. coli β2163 z pustych płytek pMaOri.dCas9 i jedną z pMaOri.dCas9sgRNA. Pozwól im rosnąć przez noc w 10 ml LB plus DAP i spektynomycyny w temperaturze 37 °C.
- Następnego dnia rozcieńczyć nasycone kultury w stosunku 1:100 w 10 ml świeżego LB plus DAP (nie uwzględniaj tutaj antybiotyku) do OD420 nm 0,2-0,4. Zwykle E. coli potrzebuje 2-3 godzin, aby osiągnąć taką gęstość.
- Wewnątrz okapu bezpieczeństwa biologicznego BSL2 zmontuj aparat filtracyjny, umieszczając filtr membranowy z mieszanych estrów celulozy o średnicy 25 mm i wielkości porów 0,1 μm na górze szklanej podstawy. Umieść szklany lejek o pojemności 15 ml na górze i przytrzymaj oba kawałki za pomocą sprężyny clamps. Podłącz szklankę do pompy próżniowej i dodaj kultury do lejka w celu filtracji.
- Dodać 5 ml kultury Leptospira do lejka. Dodaj objętość E. coli, aby uzyskać proporcję 1:1 w oparciu o wartości OD420 nm obu kultur. Włącz pompę próżniową i skoncentruj komórki przez filtrację. Po zagęszczeniu komórek w filtrze membranowym ostrożnie je odzyskaj. Upewnij się, że pożywka jest filtrowana przez membranę.
nuta: Filtracja trwa od 5 do 10 minut.
- Umieść filtr na dostępnej w handlu płytce EMJH (patrz Tabela materiałów) uzupełnionej DAP (0.3 mM). Upewnij się, że strona z bakteriami jest skierowana do góry. Inkubować płytki w temperaturze 29 °C przez 24 h.
nuta: Jeśli stosuje się HAN lub suplementowane wewnętrzne płytki EMJH, E. coli może się namnażać i przezwyciężyć zamierzoną proporcję 1:1, co z kolei może zmniejszyć wydajność koniugacji.
- Po 24 godzinach wyjmij filtry z płytek i umieść każdy pojedynczy filtr w stożkowej probówce o pojemności 50 ml.
- Użyj 1 ml ciekłego podłoża HAN, aby uwolnić komórki z powierzchni filtra poprzez intensywne pipetowanie i wirowanie.
- Wizualizacja odzyskanych mieszanych roztworów bakteryjnych za pomocą mikroskopii ciemnego pola w celu sprawdzenia żywotności i ruchliwości komórek oraz proporcji Leptospira:E. coli.
nuta: Na tym etapie można zaobserwować równoważną liczbę E. coli i Leptospira.
- Rozprowadzić 100-200 μl tej kultury na płytkach HAN zawierających 0,4% inaktywowanej surowicy królika i 40 μg/ml spektynomycyny. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C w atmosferze 3%CO2.
strong>UWAGA: Zwykle komórki L. interrogans serowar Copenhageni szczep Fiocruz L1-130 tworzą kolonie w ciągu 5-7 dni na płytkach kontrolnych i w ciągu 8-10 dni na płytkach spektynomycyny. Na tym etapie E. coli nie będą rosły, ponieważ są auksotroficzne dla DAP.
- Jako kontrolę, rozcieńczyć kultury w stężeniu 104 leptospires/ml i dodać 100 μl na płytki bez antybiotyku, w celu monitorowania wzrostu leptospirali.