Wyciszanie genów oparte na odwrotnej transfekcji siRNA in vitro: procedura dostarczania małego interferującego RNA do hodowanych komórek w celu inaktywacji ekspresji genu docelowego

Streszczenie

Źródło: Jager, J. et al.Model hodowli komórek adipocytów do badania wpływu modulacji białek i mikro-RNA na funkcję adipocytów. J. Vis. Exp. (2021).

W tym filmie opisujemy procedurę odwrotnej transfekcji siRNA do adipocytów w celu modulacji ekspresji docelowego białka.

Protokół

1. Przygotowanie wstępnie pokrytych płyt

1. Dzień przed lub kilka godzin przed transfekcją przygotować roztwór kolagenu typu I w stężeniu 100 μg/ml w 30% etanolu z roztworu podstawowego o stężeniu 1 mg/ml. Dodać 250 μl kolagenu na dołek płytki 12-dołkowej i 125 μl na dołek płytki 24-dołkowej i rozprowadzić roztwór na powierzchni dołka.
2. Pozostaw płytkę bez pokrywki pod kapturem hodowlanym, aż kolagen wyschnie. Przemyć dwukrotnie roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (D-PBS) firmy Dulbecco.
   UWAGA: Płyty wstępnie powlekane są dostępne w sprzedaży.

2. Przygotowanie mieszanki transfekcyjnej

UWAGA: Końcowe stężenie siRNA wynosi od 1 do 100 nM (1 do 100 pmol siRNA na dołek płytki 12-dołkowej). Końcowe stężenie mimiku miR wynosi 10 nM (10 pmol/dołek). Określ najlepsze stężenie każdego siRNA, mimiku miR lub innego oligonukleotydu przed rozpoczęciem eksperymentu, aby uniknąć efektów niedocelowych. Wykonaj eksperymenty transfekcji w trzech egzemplarzach, aby ułatwić analizę statystyczną wyników. Przygotować wszystkie odczynniki w nadmiarze, aby uwzględnić normalne straty podczas pipetowania.

1. Wymieszać przez pipetowanie (objętość/objętość) siRNA (lub innych oligonukleotydów) z ulepszoną minimalną pożywką niezbędną (Tabela 1). Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
2. Dodać odczynnik do transfekcji i ulepszone Minimal Essential Medium do siRNA i pipetować do mieszania (Tabela 1). Inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej (w tym czasie przejść do sekcji 3). Dodaj mieszankę transfekcyjną do każdego dołka płytki pokrytej kolagenem.

3. Przygotowanie adipocytów 3T3-L1

1. Umyć komórki na szalce Petriego o średnicy 100 mm dwukrotnie za pomocą D-PBS. Dodaj 5x trypsynę do komórek (1 ml na 100 mm szalka), upewniając się, że cała powierzchnia została pokryta trypsyną. Odczekaj 30 s i ostrożnie usuń trypsynę.
2. Inkubować szalkę Petriego przez 5-10 minut w temperaturze 37 °C w inkubatorze. Dotknij czaszy 100 mm, aby odłączyć komórki.
3. Dodaj 10 ml DMEM bez pirogronianu, 25 mM glukozy, 10% FCS oraz 1% penicyliny i streptomycyny, aby zneutralizować trypsynę. Ostrożnie pipetować pożywkę w górę i w dół, aby odłączyć komórki i homogenizować zawiesinę komórkową.
4. Policz komórki za pomocą komory liczącej Malasseza lub automatycznego licznika komórek i dostosuj stężenie komórek do 6,25 x 10⁵ komórek/ml pożywki. Wysiew: 800 μl zawiesiny komórek/dołka płytki 12-dołkowej (5 x 10⁵ komórek) lub 400 μl zawiesiny komórek/basenika płytki 24-dołkowej (2,5 x 10⁵ komórek) zawierającej mieszaninę transfekcyjną.
   nuta: Jedna 100-milimetrowa szalka Petriego z adipocytami pozwoli na przygotowanie jednej płytki 12-dołkowej lub jednej płytki 24-dołkowej. Naczynie o średnicy 100 mm zawiera zwykle 6-7 x 10⁶ adipocytów, co odpowiada 5 x 10⁵ adipocytów na dołek 12-dołkowej płytki.
5. Inkubować płytki w inkubatorze do hodowli komórkowych (7% CO2 i 37 °C) i nie naruszać komórek przez 24 godziny. Następnego dnia ostrożnie zastąp supernatant świeżym DMEM bez pirogronianu, 25 mM glukozy, 10% FCS oraz 1% penicyliny i streptomycyny.
   UWAGA: Możliwe jest również wysiewanie komórek na 48- i 96-dołkowych płytkach pokrytych kolagenem, ale należy zachować więcej środków ostrożności podczas wymiany pożywki, aby uniknąć oderwania adipocytów.

	Na studzienkę (płytka 12-dołkowa)	Na studzienkę (płytka 24-dołkowa)
Oligonukleotydy	20 μL	10 μL
(si-RNA, miR...)
Ulepszone minimalne niezbędne podłoże	20 μL	10 μL
Odczynnik do transfekcji	5,6 μl	2,8 μl
Ulepszone minimalne niezbędne podłoże	154,4 μL	77,2 μL
Całkowita objętość mieszanki transfekcyjnej	200 μL	100 μL

Tabela 1: Odczynniki do transfekcji wymagane dla płytek 12-dołkowych i 24-dołkowych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
12-dołkowa płytka do hodowli tkankowej	Holender	353043
2,5% trypsyna (10x)	Gibco (firma Gibco)	Numer katalogowy: 15090-046	Rozcieńczony do 5x za pomocą D-PBS
2-propanol	Sigma	I9516
3-izobutylo-1-metyloksantyna	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał D5879
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)	Sigma	A7030
Kolagen typu I ze skóry cielęcej	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał C8919
deksametazon	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał D1756
D-PBS (Sieć Demokratyczna)	Gibco (firma Gibco)	14190144
Zmodyfikowany średni orły Dulbecco (DMEM)	Gibco (firma Gibco)	41965062	4,5 g/l D-glukozy; L-glutamina; bez pirogronianu
etanol	Sigma	Numer katalogowy: 51976
miRIDIAN naśladuje mikro-RNA	Odkrywanie horyzontu
SiRNA kontroli ujemnej znakowanej FAM	Invitrogen	Zobacz materiał AM4620
Surowica dla nowonarodzonych cieląt	Gibco (firma Gibco)	Nr kat. 16010-159
Surowica bydlęca płodu	Gibco (firma Gibco)	Numer katalogowy: 10270-106
Penicylina i streptomycyna	Gibco (firma Gibco)	Rozdział 15140-122
SiRNA kontroli ujemnej znakowanej FAM	Invitrogen	Zobacz materiał AM4620
Mysz ON-TARGETplus Plin1 siRNA SMARTpool	Odkrywanie horyzontu	L-056623-01-0005
Wolny odczynnik glicerolowy	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał F6428
szalka Petriego 100 mm x 20 mm	Holender	353003
Odczynnik do transfekcji (INTERFERin)	Poliplus	409-10
Ulepszone podłoże Minimal Essential (Opti-MEM)	Gibco (firma Gibco)	31985-047
Insulina rekombinowana przez człowieka	Gibco (firma Gibco)	Numer katalogowy: 12585-014

powiedział: (wersja angielska) powiedział: