$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny komitet ds. opieki nad zwierzętami oraz komisję weterynaryjną JoVE.
1. Transfekcja plazmidu odpowiedzi wyrażającego gen zainteresowania (GOI) do pierwotnych komórek nabłonka pęcherzyków płucnych
- Wyizolować komórki nabłonka pęcherzyków płucnych typu II z płuc szczura.
- Zasiać komórki o gęstości 1 x 10 6 komórek/cm2 na 100 mm szalki Petriego z kompletną minimalną pożywką niezbędną (kompletny MEM). Complete MEM to MEM uzupełniony 10% FBS, 0,08 mg/L tobramycyny, Septra (3 μg/ml trimetoprimu i 17 μg/ml sulfametoksazolu), 0,2% NaHCO3, 0,01 M HEPES (pH = 7,3) i 2 mM L-glutaminy. Hodować komórki przez 24 godziny w temperaturze 37 °C w 5% CO2 w wilgotnym inkubatorze.
- Następnego dnia umieścić 500 μl kompletnego MEM bez antybiotyku w każdym dołku nowej 12-dołkowej płytki i ogrzać płytkę w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Na tym etapie ważne jest, aby stosować płodową surowicę bydlęcą wolną od zanieczyszczających tetracyklin lub o poziomie zbyt niskim, aby zakłócać indukowalność.
- Przygotować probówki o pojemności 1,5 ml zawierające plazmid z indukowalnym GOI (plazmidem GOI) i wektorem regulatorowym (np. pTet-Off), dodając 1 μg plazmidu GOI i 1 μg wektora regulatorowego na studzienkę w temperaturze pokojowej. W przypadku eksperymentów koekspresji z białkami wiążącymi RNA (RBP) do mieszanki DNA dodaje się 1 μg wektora konstytutywnego (np. pcDNA3) wyrażającego RPB będący przedmiotem zainteresowania (Figura 4).
- Odessać pożywkę i delikatnie przepłukać komórki PBS (bez wapnia i magnezu) podgrzanym w temperaturze 37 °C.
- Dodać 5 ml 0,05% trypsyny podgrzanej w temperaturze 37 °C i inkubować komórki, aż komórki zostaną odłączone (2-4 min). Zneutralizuj trypsynę, dodając 10 ml kompletnego MEM bez antybiotyku.
- Zebrać zawiesinę komórek do probówki o pojemności 50 ml, przemyć szalkę Petriego 4 ml pożywki, aby zebrać jak najwięcej pozostałych komórek, a następnie odwirować zawiesinę komórek przy 300 x g przez 5 minut.
- Delikatnie odessać i wyrzucić supernatant oraz ponownie zawiesić osad w 1 ml PBS. Policz i oblicz liczbę komórek za pomocą hemocytometru.
- Odwirować komórki przy stężeniu 300 x g przez 5 minut. Delikatnie odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w buforze do resuspensji o stężeniu 4 x 107 komórek/ml. Dodać komórki z probówki o pojemności 1,5 ml przygotowanej w kroku 2.4 w stężeniu 400 000 komórek na studzienkę i delikatnie je wymieszać, pipetując w górę i w dół.
- Umieścić probówkę w urządzeniu do elektroporacji i napełnić ją 3,5 ml buforu elektrolitycznego.
- Włóż pozłacaną końcówkę elektrody do pipety, całkowicie dociskając tłok. Delikatnie wymieszać zawartość probówki o pojemności 1,5 ml i ostrożnie odessać komórki pipetą. Uważaj, aby pęcherzyki powietrza nie dostały się do końcówki, ponieważ spowoduje to wyładowanie łukowe podczas elektroporacji i doprowadzi do zmniejszenia wydajności transfekcji.
- Włóż pipetę do stacji elektroporacji, aż usłyszysz kliknięcie.
- Wybierz odpowiedni protokół elektroporacji dla komórek nabłonka pęcherzyków płucnych, odpowiadający napięciu impulsu 1 450 V i 2 impulsom o szerokości 20 ms, a następnie naciśnij Start na ekranie dotykowym.
- Natychmiast po transfekcji wyjąć pipetę i przenieść komórki do studzienki uprzednio wypełnionej kompletnym MEM bez antybiotyku, która została wstępnie podgrzana do temperatury 37 °C.
- Powtórzyć kroki 1.11-1.14 dla pozostałych próbek.
- Delikatnie potrząśnij płytką, aby równomiernie rozprowadzić komórki na powierzchni dołka. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 w nawilżanym inkubatorze. Po 2 dniach zastąp pożywkę kompletnym MEM z antybiotykami.
- Potwierdzić powodzenie transfekcji, obserwując ekspresję eGFP pod mikroskopem fluorescencyjnym lub za pomocą cytometrii przepływowej przy użyciu wektora kontrolnego (ryc. 1).
nuta: Ten krok jest opcjonalny i wymaga dodatkowego etapu transfekcji przy użyciu innego plazmidu eksprymującego eGFP, takiego jak pcDNA3-EGFP.
2. Indukcja zahamowania transkrypcji przez rząd Indii
UWAGA: Komórki mogą być wstępnie potraktowane pożądanymi zabiegami przed indukcją doksycykliny, aby ocenić ich wpływ na stabilność mRNA (Rysunek 3).
- Przygotować roztwór podstawowy doksycykliny o stężeniu 1 mg/ml w wodzie dejonizowanej. Przechowywać roztwór podstawowy w temperaturze -20 °C w sposób bezpieczny przed światłem. Doksycyklina, pochodna tetracykliny, jest stosowana zamiast tetracykliny, ponieważ ma dłuższy okres półtrwania (2x) niż tetracyklina. Co więcej, niższe stężenie doksycykliny jest wymagane do całkowitej inaktywacji operonu tet.
nuta: Doksycyklina może wpływać na ekspresję mRNA endogennego GOI. Aby to zweryfikować, należy zbadać wpływ 24-godzinnego leczenia doksycykliną na komórki pęcherzyków płucnych, aby potwierdzić brak jakichkolwiek zmian w ekspresji GOI (ryc. 2).
- Przygotować świeży roztwór doksycykliny o stężeniu 1 μg/ml w pełnym MEM 72 godziny po transfekcji i ogrzać go do temperatury 37 °C.
- Zastąp pożywkę 1 ml kompletnego MEM zawierającego 1 μg/ml doksycykliny na studzienkę, aby zahamować transkrypcję GOI.
- Inkubować wiele dołków w temperaturze 37 °C w 5% CO2 przez różne okresy czasu od 15 minut do 6 godzin, aby ocenić okres półtrwania mRNA rządu Indii.
- Pod koniec zabiegu umyj komórki lodowatym PBS i poddaj je lizie za pomocą dostępnego w handlu zestawu do ekstrakcji fenolowo-chloroformowego RNA, dodając 500 μl buforu na studzienkę i wstrząsając płytką w celu homogenizacji komórek.
- Wyizolować RNA zgodnie z protokołem producenta. Oznaczyć wydajność i czystość RNA za pomocą spektrofotometrii przy 230, 260 i 280 nm. Próbki RNA o proporcjach 260:230 i 260:280 wynoszących odpowiednio 1,8 i 2,0 są uważane za czyste.
nuta: W tym miejscu protokół można wstrzymać.
