Binarna transformacja genów oparta na sztucznym wektorze chromosomowym u roślin Arabidopsis: technika generowania roślin transgenicznych z insercją pojedynczej kopii

Streszczenie

Źródło: Tark-Dame, M., et al. Generowanie roślin transgenicznych z pojedynczymi kopiami za pomocą wektora binarnego BIBAC-GW. J. Vis. Exp. (2018).

W tym filmie demonstrujemy generację transgenicznych roślin Arabidopsis wykazujących ekspresję stabilnego transgenu poprzez transformację binarnego sztucznego genu bakteryjnego opartego na chromosomach za pośrednictwem Agrobacterium.

Protokół

1. Arabidopsis Przekształcenie

1. Przygotuj rośliny Arabidopsis do transformacji.
   1. Uprawiaj rzodkiewnik w szklarni lub komorze wzrostu z kontrolowanym klimatem, aż zakwitną (12 doniczek po 9 roślin każda).
   2. Przypnij pierwsze, aby umożliwić pojawienie się większej liczby dodatkowych. Rośliny są gotowe do zanurzania 4–6 dni po ścięciu, kiedy rośliny mają wiele niedojrzałych główek kwiatowych i niewiele nawożonych krzemionek.
2. Zanurzanie kwiatów
   1. Zanurz kwiatostany na 5–10 s w zawiesinie Agrobacterium przenoszącej T-DNA sklonowane za pomocą binarnego sztucznego chromosomu bakteryjnego lub BIBAC. Używaj delikatnego mieszania.
   2. Owiń nadziemne części roślin folią spożywczą, aby utrzymać wysoką wilgotność, i przykryj doniczki pudełkiem, aby rośliny były w ciemności. Inkubuj rośliny przez 2 dni w szklarni/komorze wzrostowej.
   3. Wyjmij pudełko i folię spożywczą i wyhoduj rośliny do dojrzałości w szklarni/komorze wzrostowej.
      nuta: Aby zwiększyć efektywność transformacji, te same rośliny można ponownie zanurzyć 7 dni po pierwszym zanurzeniu.
   4. Zbierz nasiona. Zbierz i przeanalizuj nasiona (T1) roślin, przekształcone za pomocą tego samego konstruktu, jako pojedynczy zestaw.
3. Ekran dla roślin transgenicznych.
   1. Aby przeprowadzić badania przesiewowe pod kątem roślin transgenicznych przekształconych pochodną pBIBAC-RFP-GW, przeanalizuj nasiona za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Aby wykryć ekspresję DsRed w okrywach nasiennych, należy zobrazować nasiona przy wzbudzeniu 560 nm i emisji 600–650 nm. Oddziel nasiona fluorescencyjne od niefluorescencyjnych odpowiedników za pomocą kleszczy.
   2. Aby przesiać rośliny transgeniczne przekształcone pochodną pBIBAC-BAR-GW, wysiewaj nasiona w tacach wypełnionych ziemią (~2,500 nasion/0,1 m²). Aby zapewnić równomierne rozprowadzenie nasion na tacach, zawiesić nasiona w 0,1% agarze w 0,5x pożywce Murashige Skoog (MS) i rozprowadzić nasiona za pomocą pipety 1 ml.
      nuta: Aby pobudzić nasiona do kiełkowania w sposób synchroniczny, należy je inkubować przez co najmniej 2 dni w temperaturze 4 °C. Można to zrobić przed lub po wysianiu nasion.
      1. Spryskać sadzonki 0,5% roztworem glufosynatu amonowego 2 tygodnie i 3 tygodnie po wysianiu na tacach. Użyj 500 ml roztworu glufosynatu amonowego na 1 m².
      2. Przenieś ocalałe sadzonki do pojedynczych doniczek. Typowy obraz tacy z sadzonkami przed i po (drugim) zabiegu glufosynatem amonowym pokazano na rysunku 1.
      3. Przeanalizuj rośliny odporne na glufosynat amonu za pomocą PCR pod kątem obecności interesującego konstruktu.
         1. Wyizolować genomowe DNA roślinne do PCR.

Wyniki

Rycina 1: Taca wypełniona siewkami rzodkiewnika przed i po zabiegu glufosynatem amonowym. Siewki bez ekspresji genu bar, który jest obecny w t-DNA pBIBAC-BAR-GW T-DNA giną po spryskaniu roztworem glufosynatu amonowego. Zdjęcia pokazują tę samą tacę z sadzonkami (A) przed opryskiem glufosynatem amonowym, 14 dni po siewie i (B) 10 dni później, po dwukrotnym spryskaniu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Siarczan kanamycyny jednowodny	Duchefa powiedział:	Zobacz materiał K0126
Brama mieszaniny enzymów klonazy LR	Thermo Scientific - Invitrogen	Numer katalogowy 11791-019
Murashige Skoog średni	Duchefa powiedział:	Zobacz materiał M0221
agar	Bd	Numer katalogowy 214010
Glufosynat amonowy (Basta)	Bayer	79391781
Imager fosforowy	GE Healthcare Nauki przyrodnicze	Tajfun FLA 7000
folia spożywcza (okład Saran)	Omnilabo (Omnilabo)	1090681
Agarozy	Thermo Scientific - Invitrogen	16500

TGL szt.