$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Projekt oligo Morpholino
UWAGA: Sekwencje dla A. mexicanus są dostępne przez National Center of Biotechnology Information (NCBI) Gene i NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov), a także w przeglądarce genomu Ensembl (https://www.ensembl.org). Projektując morfolino do stosowania zarówno w formach żyjących na powierzchni, jak i w jaskiniach, kluczowe znaczenie ma zidentyfikowanie na tym etapie wszelkich różnic genetycznych między morfami, aby można było uniknąć tych regionów genetycznych jako celów dla morfolinosów. Każda zmienność polimorficzna w miejscu docelowym morfolino może prowadzić do nieskutecznego wiązania. Konstrukcja jest podobna do innych systemów rybnych, takich jak danio pręgowany, i wcześniej wykazano, że działa skutecznie u A. mexicanus.
- Projekt morfinów blokujących translację
nuta: Morfoliny blokujące translację blokują translację poprzez wiązanie się z endogennym miejscem startowym i utrudniają maszynerii translacyjnej wiązanie sekwencji mRNA przez przeszkodę steryczną.
1. Zidentyfikuj region kodujący docelowego genu, zaczynając od miejsca startowego ATG.
2. Zapisz pierwsze 25 par zasad sekwencji docelowej, kopiując i wklejając sekwencję w edytorze tekstu lub notatniku laboratoryjnym.
3. Korzystając z oprogramowania online (np. http://reverse-complement.com) lub ręcznego tłumaczenia, wygeneruj odwrotne dopełnienie sekwencji docelowej. Zapisz wynikowe odwrotne uzupełnienie w edytorze tekstu lub notatniku laboratoryjnym.
4. Zamów morfolino z odwrotną sekwencją dopełniacza w firmie produkującej oligonukleotydy morfolino. Zobacz tabelę materiałów dla firm.
2. Mikroiniekcje
- Przygotowanie ogólnych narzędzi do iniekcji
nuta: Procedury opisane w tej sekcji zostały szczegółowo opisane w innym miejscu, a przegląd z niewielkimi modyfikacjami przedstawiono tutaj.
- Wytwarzać płytki iniekcyjne, wlewając ciepłą 3% agarozę rozpuszczoną w wodzie z systemu rybnego do płytki Petriego o pojemności 100 ml. Ostrożnie umieść formę do wtryskiwania jaj w świeżo nalanej agarozie, aby zrobić dołki na ikrę ryb. Umieść bok formy w agarze pod kątem 45°, a następnie powoli opuść go do agarozy; Powolne opuszczanie formy pod kątem zapobiega uwięzieniu powietrza pod formą. Delikatnie usuń pleśń, gdy agaroza zastygnie. Płytki można przechowywać, szczelnie, w temperaturze 4 °C przez okres do 1 tygodnia.
- Pobieranie jaj w stadium jednokomórkowym
- W nocy, w której spodziewany jest lęg, sprawdzaj zbiorniki co 15–30 minut i monitoruj jaja na dnie zbiornika. Jaja wydają się półprzezroczyste, mają średnicę około 1 mm.
- Użyj siatki rybackiej o drobnych oczkach, aby zebrać jaja i przenieść je do szklanej miski wypełnionej świeżą wodą z systemu rybnego. Zbadaj jaja pod mikroskopem, aby potwierdzić, że jaja są w stadium jednokomórkowym.
- Za pomocą szklanych pipet przenieść jednokomórkowe komórki jajowe na płytki iniekcyjne. Na tym etapie wymagane są szklane pipety, ponieważ jaja będą przyklejać się do plastiku.
- Za pomocą pipety ostrożnie wypuścić jaja do dołków płytki do wstrzykiwań agarozy z ppkt 2.1. Rzędy wstępnie podgrzanej (w temperaturze pokojowej) płytki iniekcyjnej należy wypełnić maksymalną liczbą jaj (30–40 w rzędzie i do pięciu rzędów). Pełne rzędy zapobiegają przemieszczaniu się jaj podczas wstrzyknięć. Jaja należy przechowywać nawodnione na płytce iniekcyjnej z niewielką ilością wody z systemu rybnego do czasu wykonania wstrzyknięć.
- Konfiguracja wtrysku Pico i ogólne wytyczne dotyczące optymalizacji wtrysku
- Wypełnić igły iniekcyjne za pomocą końcówek do pipet z żelem, które mieszczą się w kapilarze, lub za pomocą standardowych końcówek do mikropipet, dodając na końcu bolus o objętości 2–4 μl. Po napełnieniu igły należy użyć kleszczyków, aby przyciąć nadmiar długości z igły do wstrzykiwań.
- Wykonać mikroiniekcje za pomocą igły zamontowanej w mikromanipulatorze, podłączonej do mikroiniekcji pikolitru.
- Ustaw czas wtrysku na 0,03 s, a ciśnienie wyjściowe na ~0,0 psi. Ciśnienie iniekcji będzie się odpowiednio różnić z niewielkimi różnicami między igłami, więc zoptymalizuj, aby uzyskać bolus iniekcyjny ~1,0 nL.
nuta: Ciśnienie wtrysku często mieści się w zakresie ~10–30 psi.
- Ustandaryzować bolus iniekcyjny, wstrzykując go do oleju mineralnego i mierząc rozmiar bolusa za pomocą mikrometru szkiełkowego, aby uzyskać objętość wstrzyknięcia ~1–1,5 nL. Wyreguluj ciśnienie wtrysku (psi), aby zwiększyć lub zmniejszyć objętość bolusa.
- Odciągnij wodę z samej górnej części jaj za pomocą chusteczki laboratoryjnej.
nuta: Kosmówka jajowa Astyanax jest nieco trudniejsza do przeniknięcia niż ikra danio pręgowanego. Odkryliśmy, że ściąganie wody z wierzchu jaj ułatwia penetrację igły w jaju. Optymalizacja talerza może pozwolić na ~200 jaj na jednym talerzu.
- Za pomocą mikromanipulatora przeniknąć igłą do każdego jajka i wstrzyknąć je bezpośrednio do żółtka. Po umieszczeniu w żółtku należy wstrzyknąć jajko, naciskając przycisk wstrzykiwania lub pedał nożny wstrzykiwania.
nuta: Pełną płytkę można wstrzyknąć w ciągu ~15 min. Faza jednokomórkowa trwa ~40 min.
- Wstrzyknięcie morpholinos
nuta: Ilość morfolino niezbędna do knockdownu bez powodowania toksyczności będzie musiała być zoptymalizowana dla każdego docelowego genu; Jednak stężenie 400 pg jest dobrym punktem wyjścia.
- Przygotuj morpholino tak, aby wstrzyknąć 400 pg morpholino na jajko. Rozmrozić morpholino na lodzie. Roztwór do wstrzykiwań składa się z morfoliny (w pożądanym stężeniu), H2O lub roztworu Danieau wolnego od RNaz oraz czerwieni fenolowej (10% końcowej objętości). Przykład znajduje się w tabeli 1.
- Wstrzyknąć 1 nl na zarodek.