Transgeneza danio pręgowanego za pośrednictwem transpozonu Tol2: procedura generowania transgenicznego danio pręgowanego po jednoczesnym wstrzyknięciu systemu Tol2 do zapłodnionych zarodków danio pręgowanego

Streszczenie

Źródło: Silic, M. R., et al. Wizualizacja komórkowej aktywności elektrycznej u wczesnych zarodków i nowotworów danio pręgowanego. J. Vis. Exp. (2018)

W tym filmie demonstrujemy procedurę generowania stabilnej transgenicznej linii danio pręgowanej, konstytutywnie wyrażającej fluorescencyjne białko wskaźnika napięcia po jednoczesnym wstrzyknięciu systemu transpozonów Tol2 składającego się z mRNA transpozazy i konstruktu transpozonu Tol2 kodującego wskaźnik napięcia fluorescencyjnego.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Mikroiniekcja

1. Ustaw 4-6 zbiorników hodowlanych z co najmniej 2 samcami i 2 samicami po południu przed wstrzyknięciem. Ryb tych nie wolno karmić po południu. Ten krok zmniejszy ilość odpadów rybnych i zaoszczędzi czas na ich oczyszczenie następnego ranka, a także pomoże wywołać reakcję hodowlaną.
2. Następnego ranka należy pobrać przygotowany roztwór do wstrzykiwań składający się z: (i) konstruktu transpozonu Tol2 zawierającego promotor ubikwityny danio pręgowanego i gen wskaźnika napięcia fluorescencyjnego Accelerated Sensor of Action Potentials 1 (ASAP1) oraz (ii) mRNA Tol2 z zamrażarki w temperaturze -80 °C i umieścić go na lodzie.
3. Pociągnij przegrody w zbiornikach hodowlanych ryb i pozwól rybom na łączenie się w pary. Ogólnie rzecz biorąc, ryby składają jaja w ciągu 20-30 minut po wyciągnięciu przegrody. Jeśli nie, odczekaj 1-2 godziny dłużej. Niektóre ryby mogą w ogóle nie składać jaj. W takim przypadku powtórz ten eksperyment w celu pobrania zarodków ryb.
4. Czekając, upewnij się, że są przygotowane igły z końcówką złamaną pod kątem tworzącą skośną krawędź za pomocą kleszczy lub łamiąc się na delikatnej wycieraczce zadaniowej.
   1. Wyciągnąć igły ze szkła kapilarnego na ściągaczu do mikropipet, stosując następujące parametry: ciepło 545; ciągnięcie 60; prędkość 80; czas 250; ciśnienie 500. Przełam igłę kleszczami pod lunetą preparacyjną (z linijką okularową do oszacowania średnicy), trzymając kleszcze pod kątem około 45°. Pożądane średnice igieł mogą być zmienne w zależności od ustawień mikrowstrzykiwaczy, ale mniejsza średnica jest preferowana w celu zmniejszenia śmiertelności zarodków.
5. Gdy ryby złożą jaja, zbierz je na szalkę Petriego o średnicy 10 cm i przynieś do lunety preparucyjnej. Usuń wszystkie nieprawidłowe zarodki i odchody ryb.
6. Odpipetować zapłodnione zarodki do przygotowanej 3% formy wtryskowej agarozy. Usuń nadmiar wody, aby pomóc utrzymać zarodki na miejscu.
7. Gdy wszystkie rzędy zostaną wypełnione żywotnymi zarodkami, ułóż je tak, aby wszystkie pojedyncze komórki były skierowane w tym samym kierunku w kierunku igły, czyli pod kątem około 45° w poziomie. To znacznie ułatwi późniejsze wstrzykiwanie.
8. Zakładając rękawice, użyj końcówki do pipety o pojemności 20 μl i usuń 5 μl przygotowanej konstrukcji z probówki na lodzie.
9. Ostrożnie włóż końcówkę do tylnego końca uszkodzonej rurki kapilarnej aż do miejsca, w którym zaczyna się zwężać, aby odczynnik znalazł się jak najbliżej końcówki. Jeśli nadal znajdują się pęcherzyki powietrza, potrząśnij igłą, uważając, aby nie złamać końcówki.
10. Wprowadzić igłę prosto do uchwytu igły do mikroiniekcji i ostrożnie dokręcić, aż igła pozostanie na swoim miejscu. Ustaw kąt na około 45°.
11. Po przygotowaniu i założeniu igły włącz mikroskop i zbiornik z gazem. Komercyjne zbiorniki CO₂ są na ogół dobre do tego celu. Objętość wtrysku jest regulowana przez ciśnienie utrzymywania i wyrzucania: około 0,5 psi dla podtrzymania i 30 psi dla wyrzutu. Pamiętaj, aby sprawdzić, czy roztwór pojawia się po naciśnięciu pedału.
12. Za pomocą mikrometru stopniowego z kroplą oleju mineralnego dostosuj objętość i przepływ roztworu do średnicy ~150 μm (około 2 nL). Upewnij się, że przeciwciśnienie pozwoli na wypłynięcie niewielkiej ilości z igły. Jeśli nie ma wystarczającego ciśnienia wstecznego, działanie kapilarne spowoduje, że płyn dostanie się do igły i zniszczy mRNA.
13. Po skalibrowaniu igły należy rozpocząć wstrzykiwanie konstruktu do pojedynczej komórki zapłodnionych zarodków.
    nuta: Wymaga to dużej ilości praktyki, cierpliwości i finezji, ponieważ błona komórkowa jest trudna do przebicia. Ważne jest, aby wstrzyknąć roztwór do komórki, a nie do żółtka, w celu wytworzenia transgenicznego danio pręgowanego. Różni się to od iniekcji morfolino. Nie ma znaczenia, po której stronie igła wejdzie do komórki, o ile konstrukt wejdzie do komórki. Transgeneza będzie miała bardzo niski wskaźnik sukcesu, jeśli zostanie wstrzyknięta do żółtka zamiast do komórki. Ważne jest również wstrzyknięcie w stadium jednokomórkowym, w przeciwnym razie powstaną somatyczne ryby chimery. Zmniejszy to ryzyko przedostania się transgenu do komórek rozrodczych.
14. Użyj krawędzi nacięcia na żel, aby zapewnić podkład, który utrzymuje zarodek na miejscu i umożliwia igłę wywieranie nacisku bez przesuwania zarodka. Gdy końcówka igły znajdzie się w pojedynczej komórce, naciśnij pedał, aby uwolnić żądaną ilość roztworu. Powtórz ten proces dla wszystkich zarodków.
15. Po zakończeniu przenieś wstrzyknięte zarodki do oznakowanego naczynia, wypłukując je z nacięcia agarozowego wodą z systemu rybnego i jednorazową pipetą transferową o pojemności 3,4 ml. Przechowuj zarodki w inkubatorze w temperaturze 28,5 °C, aby mogły się rozwinąć.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Agaroza RZS	Amresco (angielski)	N605-500G	Do wytwarzania żeli iniekcyjnych
Luneta preparcyjna w jasnym polu	Nikon	Zobacz materiał SMZ 745	Dechorionacja, mikroiniekcja, montaż
Jednorazowa pipeta transferowa 3,4 ml	Thermo Scientific	13-711-9 rano	Zarodki ryb i transfer wody
Kleszcze #5	Wskaźnik WPI	500342	Dechorionacja i łamanie igieł
Wskazówka dotycząca ładowania	Eppendorf	930001007	Do umieszczania roztworu do wstrzykiwań do igieł kapilarycznych
Forma do mikrowtrysku	Adaptacyjne narzędzia naukowe	Samolot TU-1	Aby przygotować tackę na pleśń agaorse do przechowywania zarodków ryb podczas wstrzykiwania
Mikrowtryskiwacz	Wskaźnik WPI	Pneumatyczna pompa pikopompująca PV820	Wtryskiwacz do mikroiniekcji
Mikromanipulator	Wskaźnik WPI	Mikrowtryskiwacz MM3301R	Operacja mikroiniekcji
Ściągacz do mikropipet	Instrument Suttera	Zobacz materiał P-1000	Do przygotowania igły kapilarnej
olej mineralny	Amresco (angielski)	J217-500ml	Do kalibracji objętości wtrysku
Plastikowe szalki Petriego	Firma VWR	25384-088	Do przetrzymywania ryb lub zarodków ryb podczas procesu obrazowania
Mikrometr sceniczny	Am Scope (Zakres	Zobacz materiał MR100	Kalibracja objętości mikroiniekcji
Cienkościenne kapilary szklane	Wskaźnik WPI	TW100F-4	Surowe szkło do wyrobu igły kapilarnej

powiedział: Regulacji)