$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Projekt gRNA dla wektora konkategomera CRISPR
UWAGA: Celem tej sekcji jest wyjaśnienie, jak wybrać najlepszą strategię targetowania i jak zaprojektować gRNA zawierające specyficzne nawisy dla wektora CRISPR-concatemer.
- Zaprojektuj gRNA w odniesieniu do genów będących przedmiotem zainteresowania, korzystając z wybranego narzędzia do projektowania gRNA CRISPR. Zobacz tabelę materiałów, aby zapoznać się z przykładem.
nuta: W przypadku celowania w parę genów paralogicznych, chociaż możliwe jest zaprojektowanie jednego gRNA na gen, zaleca się zaprojektowanie dwóch gRNA na gen, aby zwiększyć szanse na osiągnięcie podwójnego nokautu (ryc. 1).
- Upewnij się, że gRNA nie zawierają miejsca rozpoznawania BbsI, używając narzędzia do mapowania ograniczeń (patrz Tabela materiałów dla przykładu).
- Dodaj określone zwisy wektorów CRISPR-concatemer do każdego oligogo, jak pokazano w tabeli 1.
2. Klonowanie gRNA do wektora konkategorów CRISPR
- Fosforylacja i wyżarzanie oligonukleotydów
nuta: Ten krok ilustruje, jak wyżarzać górne i dolne nici dla każdego oligo gRNA i jak fosforylować ich końce w jednej reakcji.
- Przygotować mieszaninę reakcyjną do fosforylacji oligonukleotydów i wyżarzania górnych i dolnych pasm na lodzie, zgodnie z poniższymi instrukcjami.
nuta: Wszystkie oligonukleotydy można połączyć w jedną reakcję; na przykład w przypadku wektora konkatenerowego 4 gRNA, połącz ze sobą 8 oligonukleotydów.
- W przypadku 3 konkatenerów użyj 3,0 μl górnej nici gRNA (1,0 μl z każdego gRNA; 10 μM, 1 μL/gRNA), 3,0 μl dolnej nici gRNA (1,0 μL z każdego gRNA; 10 μM, 1 μL/gRNA), 2,0 μl buforu ligazy DNA T4 (10x), 1,0 μL T4 PNK i dodajH2Odo całkowitej objętości 20,0 μL.
- Dobrze wymieszaj przez pipetowanie i uruchom to w termocyklerze, stosując następujące ustawienia: 37 °C przez 30 minut, 95 °C przez 5 minut, obniż do 25 °C przy 0,3 °C/min, trzymaj w 4 °C.
- BbsI reakcja tasowania
nuta: W tej sekcji wstępnie wyżarzone oligonukleotydy gRNA są włączane do odpowiedniej pozycji wektora konkategorza w jednym kroku poprzez naprzemienne cykle trawienia i ligacji.
- Rozcieńczyć mieszaninę reakcyjną w stosunku 1:100 w wodzie wolnej od DNazy/RNazy, aby wytworzyć 3 i 4 wektory konkategorów gRNA.
nuta: Podczas klonowania 2 konkamerów gRNA ten krok nie jest potrzebny.
- Złóż reakcję tasowania kulek BbsI na lodzie, zgodnie z poniższymi instrukcjami. Uwzględnij kontrolę ujemną, która zawiera tylko wektor.
- Użyj 100 ng wektora konkategomera CRISPR, 10,0 μl mieszaniny oligo, 1,0 μl buforu enzymu restrykcyjnego zawierającego BSA (10x), 1,0 μl DTT (10 mM), 1,0 μl ATP (10 mM), 1,0 μl BbsI, 1,0 μl ligazy T7 iH2Odo całkowitej objętości 20,0 μL.
- Dobrze wymieszaj przez pipetowanie i uruchom to w termocyklerze, stosując następujące ustawienia: Uruchom 50 cykli dla klonowania 3 i 4 konkatenerów gRNA i 25 cykli dla 2 konkatenerów gRNA, oba w temperaturze 37 °C przez 5 minut, 21 °C przez 5 minut, trzymaj w temperaturze 37 °C przez 15 minut, a następnie 4 °C na zawsze.
- Leczenie egzonukleazą
nuta: Ten krok jest wysoce zalecany, ponieważ zwiększa wydajność klonowania poprzez usunięcie wszelkich śladów zlinearyzowanego DNA.
- Traktować reakcję tasowania BbsI egzonukleazą DNA (patrz tabela materiałów) w następujący sposób.
- Pobrać 11,0 μl mieszanki ligacyjnej z poprzedniego kroku (2.2.3), dodać 1,5 μl buforu egzonukleazy (10x), 1,5 μl ATP (10 mM), 1,0 μl egzonukleazy DNA i zwiększyć całkowitą objętość do 15,0 μl wodą. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut, a następnie w temperaturze 70 °C przez 30 min.
nuta: Ten etap usuwa wszelkie pozostałości zlinearyzowanego DNA w mieszaninie, a tym samym zwiększa wydajność klonowania.
- Użyj 2 μl mieszaniny reakcyjnej do przemiany w chemicznie kompetentne bakterie E. coli przez szok cieplny.
UWAGA: Alternatywnie reakcja może być przechowywana przez okres do jednego tygodnia w temperaturze -20 °C.
3. Transfekcja organoidów jelitowych za pomocą elektroporacji
UWAGA: Proszę zauważyć, że ta procedura jest oparta na protokole opublikowanym przez Fujii et al. w 2015 roku, z adaptacją do hodowli organoidów w jelicie cienkim myszy.
- Elektroporacja wstępna
nuta: W tej sekcji opisano, jak przygotować organoidy jelitowe myszy przed elektroporacją poprzez usunięcie wszystkich antybiotyków i kondycjonowanych pożywek z pożywki hodowlanej. Zapobiegnie to ewentualnym skutkom toksycznym podczas elektroporacji.
- W dniu 0 procedury transfekcji podzielić organoidy w stosunku 1:2.
UWAGA: Hodowle organoidów jelitowych można uzyskać, wykonując izolację krypty zgodnie z wcześniej ustalonymi protokołami. Proszę zapoznać się z Tabelą 2 dla wszystkich kompozycji mediów.
- Podczas dzielenia organoidów do elektroporacji należy wysiać co najmniej 6 dołków z 48-dołkowej płytki na transfekcję.
- Wysiewaj organoidy w 20 μl-kroplach macierzy podstawowej i hoduj je w pożywce WENR + Nic (Wnt + EGF + Noggin + R-spondyna + nikotynamid) w temperaturze 37 °C, 5% CO2 w wilgotnym inkubatorze (jak opisano wcześniej).
- W dniu 2 należy zmienić pożywkę, zastępując WENR+Nic 250 μl EN (EGF + Noggin) + CHIR99021 (inhibitor kinazy syntazy glikogenu-3) + Y-27632 (inhibitor ROCK), bez antybiotyków (patrz Tabela 2).
UWAGA: We wszystkich etapach ilość pożywki dodawanej do każdego dołka płytki 48-dołkowej wynosi 250 μL.
- W dniu 3 zmień pożywkę organoidową na EN + CHIR99021 + Y-27632 + 1,25% v/v dimetylosulfotlenku (DMSO), bez antybiotyków.
- Przygotowanie komórek
nuta: Tutaj opisujemy, jak rozdrobnić organoidy na małe klastry komórek poprzez dysocjację mechaniczną i chemiczną. Te kroki mają kluczowe znaczenie dla powodzenia zabiegu.
- W 4 dniu rozbij kopuły matrycy piwnicznej za pomocą końcówki pipety o pojemności 1 ml i przenieś organoidy do probówki o pojemności 1,5 ml. Zawartość czterech studzienek z 48-dołkowej płytki należy zebrać do probówki.
- Organoidy należy rozbić mechanicznie na małe fragmenty, pipetując w górę i w dół pipetą P200 około 200 razy. Wirować w temperaturze pokojowej, 5 min przy 600 x g.
- Usunąć pożywkę i ponownie zawiesić osad w 1 ml rekombinowanej proteazy klasy hodowli komórkowej (patrz tabela materiałów). Inkubować w temperaturze 37 °C maksymalnie przez 5 minut, a następnie sprawdzić kroplę próbki o objętości 50 μl pod mikroskopem światła odwróconego z obiektywem 4x.
nuta: Pożądane są klastry 10-15 komórek, ponieważ zwiększa to przeżywalność komórek po elektroporacji.
- Przenieść zawiesinę komórkową do probówki o niskim stopniu wiązania 15 ml i zatrzymać dysocjację poprzez dodanie 9 ml podłoża podstawowego bez antybiotyków (patrz Tabela 2). Odwirować w temperaturze pokojowej, 5 minut przy 600 x g, następnie odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml zredukowanej pożywki surowicy (patrz tabela materiałów).
- Policz liczbę ogniw z komorą Bürkera i użyj minimum 1 x 105 ogniw na reakcję elektroporacji. Dodać 9 ml zredukowanej pożywki surowicy do probówki o pojemności 15 ml i odwirować w temperaturze pokojowej, 3 minuty przy 400 x g.
- Elektroporacja
nuta: Poniższe sekcje zawierają instrukcje, jak przeprowadzić elektroporację i jak sprawić, by organoidy po jej zakończeniu się regenerowały.
- Usunąć cały sklarowany osad i zawiesić osad w roztworze do elektroporacji (patrz Tabela Materiałów). Dodać całkowitą ilość 10 μg DNA do zawiesiny komórkowej i dodać roztwór do elektroporacji do końcowej objętości 100 μl i utrzymać mieszaninę komórka-DNA na lodzie. Użyj wektorów konkatameru CRISPR w połączeniu z plazmidem ekspresji Cas9 (np. Addgene #41815) w stosunku 1:1.
nuta: Całkowita objętość dodanego DNA powinna być mniejsza lub równa 10% całkowitej objętości reakcji.
- Dołącz oddzielną mieszaninę transfekcyjną zawierającą plazmid GFP w celu oceny skuteczności transfekcji (np. pCMV-GFP, Addgene #11153 lub dowolny ogólny plazmid wykazujący ekspresję GFP).
- Dodaj mieszaninę komórka-DNA do kuwety do elektroporacji i umieść ją w komorze elektroporatora. Zmierz impedancję, naciskając odpowiedni przycisk na elektroporatorze i upewnij się, że wynosi 0,030-0,055 kΩ. Przeprowadzić elektroporację zgodnie z ustawieniami pokazanymi w Tabeli 3.
nuta: Jeśli wartość impedancji wykracza poza dozwolony zakres, wyreguluj objętość roztworu w kuwecie.
- Dodać 400 μl buforu do elektroporacji + Y-27632 do kuwety, a następnie przenieść całość do probówki o pojemności 1,5 ml. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut, aby umożliwić komórkom regenerację, a następnie wirować je w temperaturze pokojowej przez 3 minuty przy 400 x g.
- Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 20 μl/studzienkę matrycy podstawowej. Wysiewaj około 1 x 104 do 1 x 105 komórek na studzienkę na płytce 48-dołkowej i dodaj EN + CHIR99021 + Y-27632 + 1,25% v/v DMSO. Inkubować w temperaturze 37 °C.
- W 5 dniu zmień pożywkę na EN + CHIR99021 + Y-27632 i sprawdź skuteczność transfekcji, obserwując ekspresję GFP (rysunek 2). Utrzymać organoidy w temperaturze 37 °C i po 2 dniach odświeżyć pożywkę EN + CHIR99021 + Y-27632.
- W dniu 9 zmienić pożywkę na WENR + Nic + Y-27632 i inkubować w temperaturze 37 °C.
nuta: Y-27632 można usunąć po 7-10 dniach (w dniach 16-19).
| Kaseta 1 | Kaseta 2 | Kaseta 3 | Kaseta 4 |
| Sekwencja (5′-3′) | CACCGG[gRNA1]GT | ACCGG[gRNA2]G | CCGG[gRNA3] | ACACCGG[gRNA4]GTT |
| Sekwencja (5′-3′) | TAAAAC[RC-gRNA1]CC | AAAAC[RC-gRNA2]C | AAAC[RC-gRNA3] | CTAAAAC[RC-gRNA4]CCG |
Tabela 1: Zwisy dla każdej kasety wektora konkategoera CRISPR.
| Podłoże podstawowe | | Komentarze |
| Przechowywać w temperaturze 4 °C przez 4 tygodnie | | |
| Pożywka do hodowli komórkowych | 500 ml | Zobacz tabelę materiałów |
| L-glutamina | 100x 5 ml | |
| Środek buforujący 1 M | 5 ml | Zobacz tabelę materiałów |
| Penicylina Streptomycyna | 100x 5 ml | |
| WENR + Nic (Wnt + EGF + Noggin + Rspondin + Nikotynamid) | | |
| Przechowywać w temperaturze 4 °C przez 2 tygodnie | | |
| Podłoże podstawowe | do 50 ml | |
| Suplement bez surowicy komórek nerwowych (50x) | 1 ml | Zobacz tabelę materiałów |
| Suplement bez surowicy komórek nerwowych (100x) | 500 μL | Zobacz tabelę materiałów |
| n-acetylocysteina (500 mM) | 125 μL | |
| mysz EGF (100 μg/ml) | 25 μL | |
| mysz Noggin (100 μg/ml) | 50 μL | |
| Pożywka kondycjonowana R-Spondyną | 5 ml | |
| Pożywka kondycjonowana Wnt3a | 25 ml | |
| Amid kwasu nikotynowego (1 M) | 250 μL | |
| EN + CHIR + Y-27632 (EGF + Noggin + CHIR + Y-27632) | | |
| Przechowywać w temperaturze 4 °C przez 2 tygodnie | | |
| Podłoże podstawowe bez penicyliny Streptomycyny | do 20 ml | |
| Suplement bez surowicy komórek nerwowych (50x) | 400 μL | Zobacz tabelę materiałów |
| Suplement bez surowicy komórek nerwowych (100x) | 200 μL | Zobacz tabelę materiałów |
| n-acetylocysteina (500 mM) | 50 μL | |
| mysz EGF (100 μg/ml) | 10 μL | |
| mysz Noggin (100 μg/ml) | 20 μL | |
| Y-27632 (10 μM) | 20 μL | |
| CHIR99021 (8 μM) | 10 μL | |
| EN (EGF + Noggin) | | |
| Przechowywać w temperaturze 4 °C przez 4 tygodnie | | |
| Podłoże podstawowe | do 50 ml | |
| Suplement bez surowicy komórek nerwowych (50x) | 1 ml | Zobacz tabelę materiałów |
| Suplement bez surowicy komórek nerwowych (100x) | 500 μL | Zobacz tabelę materiałów |
| n-acetylocysteina (500 mM) | 125 μL | |
| mysz EGF (100 μg/ml) | 25 μL | |
| mysz Noggin (100 μg/ml) | 50 μL | |
Tabela 2: Skład podłoża organoidowego.
.
| Puls porowy | Impuls transferowy |
| napięcie | 175V | 20V |
| Długość impulsu | 5 ms | 50 ms |
| Interwał impulsów | 50 ms | 50 ms |
| Liczba impulsów | cyfra arabska | 5 |
| Szybkość zaniku | 10% | 40 proc |
| biegunowość | + | +/- |
Tabela 3: Ustawienia elektroporacji.
