Sterowana obrazem zrobotyzowana mikroiniekcja komórek: zautomatyzowana technika o wysokiej przepustowości do precyzyjnego dostarczania znakowanych fluorescencyjnie polisacharydów do pojedynczych komórek neuronalnych w organotypowych kulturach wycinków mózgu

Streszczenie

Źródło: Shull, G. i wsp. Manipulacja pojedynczymi nerwowymi komórkami macierzystymi i neuronami w wycinkach mózgu przy użyciu mikroiniekcji robotycznej. J. Vis. Exp. (2021)

W tym filmie demonstrujemy zrobotyzowaną mikroiniekcję znakowanych fluorescencyjnie polisacharydów do neuronów piramidowych w organotypowych wycinkach embrionalnego mózgu myszy za pomocą automatycznego wstrzykiwacza. Automatyczny wstrzykiwacz to platforma robologiczna, która wykorzystuje obrazy uzyskane z mikroskopu do precyzyjnego dostarczania interesujących biomolekuł do pojedynczych komórek.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Instalacja oprogramowania

1. Postępuj zgodnie z instrukcjami, aby zainstalować oprogramowanie z https://github.com/bsbrl/Autoinjector.

2. Przygotowanie odczynników i pipet

1. Agaroza: Przygotować 3% agarozy, rozpuszczając oddzielnie 3 g agarozy o szerokim zakresie i 3 g agarozy o niskiej temperaturze topnienia w 100 ml PBS klasy hodowli komórkowej odpowiednio w dwóch oddzielnych szklanych butelkach o pojemności 200 ml. Przechowywać w temperaturze pokojowej do 3 miesięcy.
2. Roztwór Tyrode: Rozpuścić 1 g wodorowęglanu sodu i soli Tyrode'a (użyć zawartości całej butelki) oraz 13 ml 1 M HEPES w 1 l wody destylowanej. Dostosować pH do 7,4. Przefiltrować roztwór przez filtr butelkowy 0,2 μm.
3. Pożywka do hodowli w plastrach (SCM): Dodaj 10 ml surowicy szczurów, 1 ml 2 ml glutaminy, 1 ml penicyliny-streptomycyny (100x), 1 ml suplementu N-2 (100x), 2 ml suplementu B27 (50x) i 1 ml buforu HEPES (pH 7,3) do 84 ml pożywki neurobazalnej. Porcję 5 ml SCM do probówek o pojemności 15 ml. Przechowywać w temperaturze -20 °C.
4. Pożywka do mikroiniekcji niezależna od CO₂ (CIMM): Przygotować 5x modyfikowany DMEM roztwór o niskiej zawartości glukozy (bez czerwieni fenolowej), rozpuszczając proszek w 200 ml wody destylowanej. Przefiltruj roztwór przez filtr butelkowy 0,2 μm (w przypadku proszku DMEM użyj zawartości całej butelki). Aby przygotować 100 ml CIMM, wymieszaj 20 ml 5x roztworu modyfikowanego DMEM, 1 ml buforu HEPES, 1 ml suplementu N2 (100x), 2 ml suplementu B27 (50x), 1 ml penicyliny-streptomycyny (100x), 1 ml 2 mM glutaminy i 74 ml wody destylowanej. Przechowywać roztwór w temperaturze 4 °C.
5. Bufor do rozpuszczenia: Przygotować bufor do rozpuszczenia, rozpuszczając 262 mM NaHCO₃, 0,05 N NaOH, 200 mM HEPES w wodzie destylowanej. Wysterylizuj roztwór przez filtrację przez system filtrów 0,22 μm do sterylnej szklanej butelki. Porcję 500 μl buforu do rozpuszczenia w hermetycznych probówkach do mikrowirówek. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
6. Barwnik do mikroiniekcji: Rozpuść znakowany fluorescencyjnie dekstran w wodzie destylowanej wolnej od RNaz (końcowe stężenie 10 μg/μL). Przygotować 5 μl porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu użycia.
7. Wyciągnij pipety do mikroiniekcji z kapilar ze szkła borokrzemianowego (średnica zewnętrzna 1,2 mm, średnica wewnętrzna 0,94 mm) za pomocą ściągacza do mikropipet. Chroń pipety przed kurzem. Nie przechowuj pipet dłużej niż 2–3 dni. W tym eksperymencie parametrami ciągnięcia były CIEPŁO: temperatura rampy +1 – 5; UCIĄG: 100; VEL: 110; DEL: 100. HEAT i VEL to parametry, które mają największy wpływ na kształt i rozmiar pipety.
   nuta: Optymalna pipeta do mikroiniekcji ma długą i elastyczną końcówkę, aby uniknąć uszkodzenia komórek podczas mikroiniekcji.

3. Przygotowanie plastra tkanki

1. Rozpuść 3% agarozę o szerokim zakresie za pomocą kuchenki mikrofalowej przed sekcją tkanki mózgowej. Nie dopuścić do zestalenia się agarozy, przechowując ją w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C przed osadzeniem. Upewnij się, że pipety są chronione przed kurzem. Nie przechowuj pipet dłużej niż 2–3 dni.
2. Rozmrozić podwielokrotność SCM i ogrzać 10–12 ml CIMM i 20 ml roztworu Tyrode'a do temperatury 37 °C w łaźni wodnej.
3. Zmieszać znacznik fluorescencyjny (sprzężony z Dextran-3000 lub Dextran-10000-Alexa; stężenie końcowe 5–10 μg/μl) z innymi substancjami chemicznymi, które mają być wstrzyknięte. Odwirować roztwór do mikroiniekcji o sile 16 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Zebrać supernatant i przenieść do nowej probówki. Roztwór do mikroiniekcji należy przechowywać na lodzie do czasu użycia.
4. Użyj głów z zarodków myszy E13.5–E16.5, aby przygotować organotypowe wycinki tkanki kresomózgowia. Usuń skórę i otwórz czaszkę za pomocą kleszczy, przesuwając się wzdłuż linii środkowej. Wypreparuj mózg embrionalny z otwartej czaszki i usuń opony mózgowe pokrywające tkankę mózgową, zaczynając od brzusznej strony mózgu. Pozostaw wypreparowany cały mózg w roztworze Tyrode'a na bloku grzewczym o temperaturze 37 °C.
   nuta: Wszystkie etapy preparacji opisane w ppkt 3.4 muszą być wykonane w podgrzanym roztworze Tyrode.
5. Wlej szeroką gamę stopionej agarozy do jednorazowej formy do zatapiania. Gdy agaroza zostanie schłodzona do temperatury 38–39 °C, ostrożnie przenieś do niej mózgi (maksymalnie 4) za pomocą pipety Pasteura. Na tym etapie zawsze używaj końcówek do wycinania.
6. Wymieszaj agarozę wokół tkanki za pomocą szpatułki lub kleszczy Dumont #1 bez dotykania tkanki. Niech agaroza zestali się w temperaturze pokojowej. Gdy agaroza zastygnie, odetnij nadmiar agarozy otaczającej tkankę.
7. Napełnij tacę buforową PBS. Ustaw mózg tak, aby oś rostro-ogonowa tkanki była prostopadła do tacy (użyj jako punktu orientacyjnego opuszki węchowe, reprezentujące najbardziej rostralną część mózgu). Pokrój plastry 250 μm za pomocą wibratomu.
8. Napełnij szalkę Petriego o średnicy 3,5 cm 2 ml podgrzanego podłoża. Za pomocą plastikowej pipety Pasteura przenieś plastry (10–15) do tego naczynia. Po zakończeniu przenieś szalkę Petriego z plastrami do inkubatora do hodowli plastrów. Plastry należy przechowywać w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze zawierającej 40%_O2 / 5% CO₂ / 55% N₂ do momentu użycia.

4. Mikroiniekcja

1. Włącz komputer, mikroskop, kamerę mikroskopową, manipulatory, zestaw ciśnieniowy i czujnik ciśnienia. Załaduj aplikację, klikając plik "launchapp.py" w głównym folderze pobranym z GitHub i określ ustawienia urządzenia na wyskakującym ekranie (instrukcje instalacji znajdują się w kroku 1.1).
2. Wytworzyć ciśnienie na zewnątrz, aby zapobiec niepożądanemu zatkaniu przed zanurzeniem pipety w roztworze. Aby wywrzeć nacisk na pipetę, przesuń pasek kompensacji ciśnienia do pozycji 24–45% i kliknij przycisk Set Values (Ustaw wartości). Następnie dostosuj ciśnienie do wystarczającego ciśnienia, przekręcając pokrętło mechanicznego zaworu ciśnienia na 1–2 PSI (69–138 mbar), zgodnie ze wskazaniami czujnika ciśnienia.
3. Przenieś plastry na 3,5 cm szalkę Petriego zawierającą 2 ml wstępnie podgrzanego CIMM. Umieść plastry do mikroiniekcji na środku szalki Petriego. Przenieść szalkę Petriego do wstępnie podgrzanego (37 °C) etapu mikroiniekcji.
4. Napełnij pipetę do mikroiniekcji 1,4–1,6 μl roztworu do mikroiniekcji (z kroku 3.3) za pomocą plastikowej pipety z długą końcówką. Włożyć pipetę do mikroiniekcji na uchwyt na pipetę.
5. Używając najmniejszego powiększenia mikroskopu, ustaw ostrość wycinka i skieruj mikropipetę na to pole view (FOV) tak, aby była skupiona na tej samej płaszczyźnie co tarcza wycinka. Przełącz wyjście mikroskopu na kamerę, aby zobaczyć pole widzenia w aplikacji.
6. Kliknij przycisk powiększenia w lewym górnym rogu interfejsu, aby rozpocząć kalibrację urządzenia. Pojawi się okno z prośbą o wybranie powiększenia. Wybierz powiększenie 10x lub dowolne powiększenie, na które ustawiony jest obiektyw (np. 4x, 10x, 20x, 40x) i naciśnij OK. Oprogramowanie zakłada, że wewnętrzna soczewka obiektywu ma powiększenie 10x (najczęstsze powiększenie soczewki obiektywu).
7. Ponownie ustaw ostrość końcówki pipety za pomocą pokrętła mikrometrycznego mikroskopu i kliknij końcówkę pipety kursorem. Następnie naciśnij przycisk kroku 1.1 i naciśnij OK w wyskakującym okienku. Pipeta przesunie się w kierunku Y. Kliknij końcówkę pipety i naciśnij przycisk kroku 1.2. Na koniec wprowadź wartość 45 w polu Kąt pipety i naciśnij przycisk Ustaw kąt.
8. Wprowadź żądane parametry do panelu sterowania Automatyczne mikroiniekcje. W przypadku mikroiniekcji do wierzchołkowych komórek progenitorowych należy ustawić odległość iniekcji na 20–40 μm, a głębokość na 10–15 μm. W przypadku mikroiniekcji do neuronów należy ustawić odległość iniekcji 30–40 μm od strony podstawy, a głębokość na 10–30 μm, w zależności od tego, co jest celowane. Zawsze ustawiaj prędkość na 100%. Kliknij przycisk Ustaw wartości.
   nuta: Odległość zbliżeniowa to odległość, na jaką pipeta wyciąga się z tkanki przed przejściem do następnej odległości wstrzyknięcia, głębokość to głębokość w tkance, w którą przechodzi mikroiniekcja, odstępy to odległość wzdłuż linii między sekwencyjnymi wstrzyknięciami, prędkość to prędkość pipety w μm/s.
9. Kliknij przycisk Narysuj krawędź i przeciągnij kursor wzdłuż żądanej trajektorii w wyskakującym okienku, aby zdefiniować trajektorię wstrzyknięcia. W przypadku mikroiniekcji progenitorowych komórek macierzystych celem jest brzuszna strona powierzchni kresomózgowia. Przesuń pipetę na początek linii i kliknij końcówkę pipety. Kliknij opcję Uruchom trajektorię, aby rozpocząć mikrowstrzykiwanie. Powtórz ten krok dla każdej docelowej płaszczyzny iniekcji (zwykle wykonuje się to dla 3–4 płaszczyzn z 40–75 iniekcjami na płaszczyznę).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Chemicals
Agarose, niskotopliwy	Carl Roth	Cat# 6351.2
Agarose, Wild Range	Sigma-Aldrich	Cat# A2790
Best-CA 221 Glue	Best Klebstoffe GmbH & Co.KG	Cat# CA221-10ml
B-27 Suplement	Thermo Fisher Scientific	Cat# 17504044
			destylowana
DMEM-F12, niezależna od CO2 (bez czerwieni fenolowej)	Sigma-Aldrich	Cat# D2906
DMEM-F12, niezależna od CO2 (z czerwienią fenolową)	Sigma-Aldrich	Cat# D8900
HEPES-NAOH, pH 7,2, 1M (bufor HEPES)	Carl Roth	Cat# 9105.3
L-glutamina, 200 mM	Thermo Fisher Sientific	Cat# 25030024
Mowiol 4-88	Sigma-Aldrich	Cat# 81381
N-2 Suplement	Thermo Fisher Scientific	Cat# 17502048
Neurobasal Medium	Thermo Fisher Scientific	Cat# 21103049
Woda wolna od nukleaz	Thermo Fisher Scientific	Cat# AM9937
O2 (40%), CO2 (5%), N2 (55%) Mix, 50 litrów
PBS
Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/ml)	Thermo Fisher Scientific	Cat# 15140122
Surowica szczura	Charles River Laboratories
Wodorowęglan sodu (NaHCO3)	Merck	Cat# 106323
Wodorotlenek sodu (NaOH)	Merck	Cat# 106482
Tyrode' s sól	Sigma	Cat# T2145-10x1L)
Equipment
kapilary ze szkła borokrzemianowego, średnica zewnętrzna 1,2 mm x średnica wewnętrzna 0,94 mm	Sutter Instruments	Cat# BF-120-94-10
System filtrów butelkowych, 500 mL	Corning	Cat# 430769
Komputer PC
Niestandardowy platforma ciśnieniowa	Niestandardowa platforma
. 3	Narzędzia do nauki o nauce	kat. # 11231-30
Kleszcze, Dumont nr 5	Narzędzia do nauki o naprawach	kat. # 11255-20
Kleszcze, Dumont nr 55	Narzędzia do nauki o naprawach	kat. # 11252-20
Blok grzewczy	Labtech International	Cat # Dri blok Digi2
Mikroskop fluorescencyjny odwrócony	Zeiss	Cat# Axiovert 200
Źródło światła	Olympus	Cat# Highlight 3100
Ręczny regulator ciśnienia	McMaster Carr	Cat# 0-60 PSI 41795K3
Końcówki do mikroładowarek	Eppendorf	Cat# 5242956.003
Mikrokontroler	Arduino	Cat# Arduino Due
Kamera mikroskopowa Hamamatsu Orca Flash 4.0 V3
Zmotoryzowany stopień XY dla
Pipety Pasteura, plastikowa
szalka Petriego, 60 x 15 mm	Greiner	Cat# 628102
szalka Petriego, 35 x 10 mm	Nunc	Cat# 153066
szalka Petriego, 34 x 14 mm, z Microwell nr 1.5 szklana osłona	MatTek	Cat# P35G-1.5-14-C
Uchwyt na pipety	Warner Instruments	Cat# 64-2354 MP-s12u
Pipeta i końcówki
Filament ściągacza, 3,0 mm kwadratowy filament	Sutter Instrument	Cat# FB330B
Pudełko do inkubacji kultur plasterkowych	MPI-CBG	Cat# wykonane na zamówienie
Zawór elektromagnetyczny	Cat# LHDA053321H-A
Wirówka stołowa	Heraeus	Cat# 5431622
Termometr
Manipulator trójosiowy	Sensapex Inc	Cat# oś drzewa uMP
Vibratome	Leica	Cat# VT1000s
Inkubator systemu hodowli całych zarodków	Ikemoto Company	Cat# RKI-10-0310
Waterbath
Software and Algorithms
Arduino	Arduino
Fiji	RRID: SCR_002285
Python	Python Podstawy oprogramowania	Python 2.7.12
ZEN		RRID: SCR_013672