Barwienie fioletem krystalicznym: technika wizualizacji lekoopornych komórek nowotworowych za pomocą testów tworzenia kolonii

Streszczenie

Źródło: Mohr, L. et al., Generacja modeli komórkowych raka prostaty oporności na środek antymitotyczny Docetaxel. J. Vis. Exp. (2017)

W tym filmie demonstrujemy test żywotności komórek za pomocą procedury barwienia fioletem krystalicznym dla chemoterapeutycznie opornych na leki komórek nowotworowych.

Protokół

1. Funkcjonalna charakterystyka nabytej odporności na docetaksel za pomocą testu tworzenia kolonii

UWAGA: W tym protokole, chemooporność została oceniona za pomocą testów tworzenia kolonii. Alternatywne metody stosowane do oceny żywotności komórek (tj. testy MTS) mogą być stosowane w oparciu o preferencje badaczy.

1. Umieść 2,000 komórek (DU145 lub 22Rv1, zarówno rodzicielskich, jak i opornych na docetaksel) na dołku na płytkach 6-dołkowych, używając 2 ml pożywki na studzienkę.
2. Po 24 godzinach dodać zwiększające się stężenia docetakselu (komórki rodzicielskie: 0,25, 0,5, 1, 2,5 i 5 nM; Komórki DR: 50, 125, 250, 500 i 1,000 nM) zarówno dla linii komórkowych DU145, jak i 22Rv1. Dodać DMSO tylko do jednego dołka jako kontrolnego o tej samej objętości, co dla najwyższej dawki docetakselu.
3. Po 72 godzinach odessać pożywkę zawierającą lek i dodać świeżą pożywkę wolną od docetakselu.
4. Inkubuj płytki przez 1-2 tygodnie, aż kolonie będą widoczne pod mikroskopem.
5. Aby zabarwić kolonie, umyj je delikatnie 2-3 ml PBS i inkubuj z 2-3 ml roztworu fioletu krystalicznego (0,1% w/v w 10% formalinie) przez 20 minut w kapturze do hodowli tkankowej lub okapie oparowym.
6. Usunąć roztwór barwiący i umyć płytki 2-3 ml_H2O, usunąć_H2Oi wysuszyć płytki na powietrzu.
7. Analizuj wynik, wizualizując dołki i ręcznie licząc kolonie za pomocą markera (aby uniknąć dwukrotnego liczenia tych samych kolonii) i przedstaw procent żywotności komórek na wykresie. Wykonaj cyfrowe zdjęcia płyt w celu przedstawienia figury (Rysunek 1).

Wyniki

Rycina 1: Charakterystyka funkcjonalna i fenotypowa modeli komórkowych opornych na docetaksel. Reprezentatywne testy tworzenia kolonii komórek rodzicielskich i opornych na docetaksel poddanych działaniu wskazanych stężeń docetakselu przez 72 godziny. Odsetek kolonii dla każdego stężenia poddanego działaniu substancji jest przedstawiony na dołączonym wykresie. Eksperymenty są trzyczęściowe, a dane reprezentują średnią ± SD. Podziałk...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Ogniwa DU145	Kontroler ATCC (Kontroler T	Zobacz materiał HTB-81
Ogniwa 22Rv1	Kontroler ATCC (Kontroler T	CRL-2505
Docetaksel	Selleck Chemikalia	Zobacz materiał S1148	w DMSO (10mM)
6-dołkowe płytki do hodowli tkankowych	sokół	353046
RPMI 1640 Średni	Gibco (firma Gibco)	11875093	Uzupełniony 10% FBS i 1% Penicilin/Streptomycyna
Fundacja B Surowica bydlęca płodu	Bliźnięta	900208
1X sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)	Corning	21-040-CM
Kryształowy fiolet	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał C0775
10% roztwór formaliny	Sigma-Aldrich	HT501128

powiedział: