$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Protokół barwienia srebrem
- Przygotuj wcześniej wszystkie roztwory niezbędne do barwienia srebra (Tabela 1).
nuta: Nie dotykaj bezpośrednio żelu PAGE, dopóki nie zostanie on zabarwiony, rozwinięty i umieszczony w roztworze zatrzymującym. Zamiast tego manipuluj żelem za pomocą czystych plastikowych lub szklanych narzędzi. Bezpośrednie obchodzenie się z żelem spowoduje zniekształcenia odcisków palców i inne widoczne artefakty na żelu po barwieniu.
- Po zakończeniu przebiegu, zdemontuj kasetę i ekstrahuj żel do czystego, średniego-dużego pojemnika wypełnionego dejonizowaną, przefiltrowaną wodą.
nuta: Aby uniknąć bezpośredniego kontaktu z żelem, użyj końcówki pipety lub innego plastikowego przedmiotu, aby delikatnie oderwać żel od kasety, gdy jest zanurzony w wodzie. Żel może być delikatny - należy obchodzić się z nim ostrożnie.
- Wylej wodę. Zabarwić żel w roztworze barwiącym Alcian blue przez 5 min.
- Odrzuć niebieską plamę Alciana. Szybko spłucz/umyj 2-3x dejonizowaną, przefiltrowaną wodą, aż większość roztworu barwiącego Alcian blue zostanie usunięta.
- Pozostaw na noc do odbarwienia w dejonizowanej, przefiltrowanej wodzie na bujaku. Upewnij się, że jest wystarczająca ilość dejonizowanej, przefiltrowanej wody, aby zapewnić, że wszelkie resztki plamy zostaną całkowicie zmyte z żelu przez noc.
- Żel do mycia w 50% metanolu (łącznie 40 minut, zmień roztwór 2-3x).
- Żel myć w dejonizowanej, przefiltrowanej wodzie przez 30 min. Wylej wodę i powtórz jeszcze 3 razy, w sumie przez 2 godziny, za każdym razem wymieniając wodę.
- W świeżym, czystym pojemniku barwić żel przez 30 minut w roztworze barwiącym z azotanu srebra.
- Szybko spłucz/umyj 2-3x w dejonizowanej, przefiltrowanej wodzie, aby całkowicie usunąć roztwór do barwienia srebra.
- Myć przez 30 min w dejonizowanej, przefiltrowanej wodzie. Wylej wodę i powtarzaj 2x przez łącznie 90 minut, za każdym razem wymieniając łaźnię wodną.
- Wylej wodę i dodaj roztwór rozwijający.
- Po dodaniu roztworu do wywoływania należy uważnie obserwować żel i obserwować pojawienie się pasków. W zależności od jakości plamy i masy załadowanej próbki, wywołanie może trwać od kilku sekund do kilku minut.
- Gdy tylko pożądane pasma staną się widoczne, natychmiast wyrzuć rozwijający się roztwór i krótko przemyj roztworem zatrzymującym.
- Wyrzuć roztwór zatrzymujący, umyj go i zastąp świeżym roztworem zatrzymującym. Pozostawić do namoczenia na 1 godzinę na bujaku lub shakerze.
- Myć przez noc w dejonizowanej, przefiltrowanej wodzie (jednak żel można zobrazować natychmiast po przemyciu roztworem).
Tabela 1: Roztwory wymagane do barwienia srebrem glikozaminoglikanów oddzielonych elektroforezą w żelu poliakrylamidowym. Wszystkie roztwory należy przefiltrować (0,22 μm) przed użyciem.
| UWAGA: Wszystkie roztwory muszą być przefiltrowane (0,22μm) przed użyciem. |
| rozwiązanie | przepis | kompozycja | Komentarze |
| Niebieski roztwór barwiący Alcian (500mL) | Niebieski Alcian 8GX w proszku | 2,5 gr | Pożądane stężenie: 0,5% w/v |
| 2% v/v lodowaty kwas octowy | 500 ml | |
| Srebrna plama (200 ml) | Dejonizowana | 192,7 ml | Roztwór do barwienia przygotować na świeżo, zużyć w ciągu tygodnia. |
| 7,6 M wodorotlenek sodu | 2 ml | Aby zrobić, dodaj 3,04 g granulek wodorotlenku sodu do 10 ml wody |
| Wodorotlenek amonu | 3,3 ml | |
| Roztwór azotanu srebra 4M | 2 ml | Aby zrobić, dodaj 3,397 g azotanu srebra do 5 ml wody. Dodawaj kroplami, mieszając, aby uniknąć wytrącania się. |
| Rozwijanie roztworu (501 ml) | Dejonizowana | 500 ml | Roztwór do wywoływania musi być świeży i zużyty w ciągu 24 godzin. |
| 2,5% w/v kwasu cytrynowego | 1 ml | Aby zrobić, dodaj 100 mg do 4 ml wody dejonizowanej. Kwas cytrynowy musi być świeży. |
| Formaldehyd | 250μL | |
| Zatrzymaj roztwór (500 ml) | Dejonizowana | 300 ml | |
| Lodowaty kwas octowy | 20 ml | |
| metanol | 90 ml | |