Barwienie Sudan IV: procedura barwienia blaszek miażdżycowych obciążonych lipidami w pobranym łuku aorty myszy

Streszczenie

Źródło: Centa, M., et al. Kwantyfikacja miażdżycy u myszy. J. Vis. Exp. (2019 rok)

Ten film demonstruje procedurę z użyciem barwnika Sudan IV do barwienia złogów tłuszczu w pobranym łuku aorty myszy w celu wizualizacji blaszek miażdżycowych i określenia zakresu miażdżycy.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny komitet ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE

1. Analiza en face łuku aorty i tętnicy ramienno-głowowej

1. Przygotuj łoża pinowe do analizy en face łuków aorty. Złóż segment folii parafinowej osiem razy, aby uzyskać płaską powierzchnię o wymiarach 25 mm x 25 mm. Owiń go czarną taśmą izolacyjną, aby stworzyć ciemne tło dla aorty. Umieść etykietę z tyłu łoża do przypinania i użyj ołówka, aby napisać numer identyfikacyjny myszy (normalny atrament w długopisie zniknie w procesie barwienia).
2. Przenieś łuk aorty na łożysko przypinające i umieść na nim kroplę PBS. Rozpocznij oczyszczanie aorty z pozostałej tkanki tłuszczowej okołoprzybyszowej pod mikroskopem stereoskopowym.
   1. Użyj nożyczek Vannas i kleszczyków Dumont, aby delikatnie usunąć całą otaczającą tkankę tłuszczową bez manipulowania lub uszkadzania aorty. Sudan IV zabarwi tkankę tłuszczową na jasno i w tym momencie bardzo ważne jest, aby usunąć całą taką tkankę.
      nuta: Utrzymuj aortę wilgotną przez cały czas, stosując w razie potrzeby dodatkowy PBS.
3. Rozetnij aortę w płaszczyźnie koronalnej, wprowadzając nożyczki Vannas w światło aorty, aby odsłonić powierzchnię błony wewnętrznej. Zacznij przecinać zewnętrzną krzywiznę łuku wstępującego w kierunku dystalnym i kontynuuj rozcinanie gałęzi, w tym tętnicy ramienno-głowowej. Oszczędź grzbietową część zstępującego obszaru piersiowego.
   1. Rozetnij mniejszą krzywiznę i złóż aortę, aby wyświetlić powierzchnię wewnętrzną.
      nuta: Ten krok wymaga umiejętności motorycznych i wymaga trochę praktyki, aby go opanować.
4. Przypnij otwarty łuk do łóżka do przypinania za pomocą końca drobnych szpilek do owadów. Użyj mikrouchwytu na igły Castroviejo, aby umieścić szpilki na miejscu. Delikatnie odkręć kołki od próbki, gdy są na miejscu. Przypnij aortę płasko do łóżka bez rozciągania próbki. Przechowywać przypięty łuk skierowany w dół na szalce Petriego wypełnionej PBS w temperaturze 4 °C.
   nuta: W tym miejscu protokół można wstrzymać.
5. Przygotuj roztwór roboczy Sudanu IV. Wymieszaj 1 g proszku Sudan IV, 100 ml 70% etanolu i 100 ml acetonu w ciemnej butelce i delikatnie mieszaj przez 10 minut. Nie ma potrzeby filtrowania roztworu i można go używać przez kilka miesięcy, jeśli jest ciemno w temperaturze pokojowej. Jeśli kolor barwienia nie jest zadowalający, można wykonać nowy roztwór i ponownie wybarwić próbki.
   ostrożność: Aceton to łatwopalna ciecz, która może powodować poważne podrażnienie oczu. Przechowywać w dobrze wentylowanym miejscu i podjąć środki ostrożności podczas obchodzenia się z produktem leczniczym.
6. Ułóż pięć szalek Petriego na stole laboratoryjnym: jedną wypełnioną 70% etanolem, jedną wypełnioną roztworem roboczym Sudan IV, dwie wypełnione 80% etanolem i jedną wypełnioną PBS.
   1. Rozpocznij od płukania próbki w 70% etanolu przez 5 minut, umieszczając łoże do przypinania na pierwszej szalce Petriego z łukiem skierowanym w dół. Przenieś próbkę do roztworu roboczego Sudan IV i pozwól jej zabarwić łuk przez 7 minut.
   2. Następnie dwukrotnie spłucz 80% etanolem przez 3 minuty, aby usunąć normalną powierzchnię błony wewnętrznej. Czas odbarwiania można dostosować w celu optymalizacji wyników. Na koniec spłucz w PBS przed ponownym włożeniem próbki do oryginalnej szalki Petriego.
7. Uzyskaj mikrofotografie za pomocą mikroskopu stereoskopowego w 10-krotnym powiększeniu podłączonego do aparatu cyfrowego. Zrób zdjęcia przypiętego łuku zanurzonego w PBS za pomocą małych metalowych ciężarków (20 mm x 10 mm x 5 mm), aby przytrzymać łoże przypinające do dna szalki Petriego.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
taśma elektroizolacyjna (szerokość 50 mm)	Każdy wyspecjalizowany sprzedawca		Do tworzenia łożysk przypinających dla łuków aorty.
Nożyczki preparacyjne (10 cm, proste)	Światowe instrumenty precyzyjne	Numer katalogowy: 14393	Do ogólnego rozwarstwiania narządów.
Kleszcze Dumont #5 (11 cm, proste)	Światowe instrumenty precyzyjne	500341	Do mikrodysekcji aorty.
Etanol 70% (v/v)	Firma VWR Chemicals	Numer katalogowy: 83801.29	Wysoce łatwopalną ciecz i parę, przechowywać w dobrze wentylowanym miejscu i przechowywać w chłodnym miejscu.
Absolutny etanol ≥99,8%	Firma VWR Chemicals	20821.31	Wysoce łatwopalną ciecz i parę, przechowywać w dobrze wentylowanym miejscu i przechowywać w chłodnym miejscu.
Formaldehyd 4% stabilizowany, buforowany (pH 7,0)	Firma VWR Chemicals	9713.1	Działa szkodliwie przez drogi oddechowe, w kontakcie ze skórą i po połknięciu.
Izopropanol	Merck	1096341011	Łatwopalna ciecz, powoduje poważne podrażnienie oczu i może powodować senność lub zawroty głowy.
Uchwyt na igły Micro Castroviejo (9 cm, prosty)	Światowe instrumenty precyzyjne	503376	Do przypinania łuków aorty.
Szpilki do owadów Minutien, 0,10 mm	Narzędzia naukowe	26002-10	Do przypinania łuków aorty.
Parafilm M	Bemis	Zobacz materiał PM992	Film parafinowy używany do tworzenia łożysk pinowych dla łuków aorty.
Solanka fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)	-	-	Do perfuzji myszy wymagany jest sterylny i wolny od RNaz roztwór
Mikroskop stereoskopowy	Mikrosystemy Leica	MZ6	Do sekcji zwłok i dokumentacji en face
Sudan IV	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał S4261	Nie sklasyfikowana jako substancja lub mieszanina stwarzająca zagrożenie.
Nożyczki Vannas (8 cm, proste)	Światowe instrumenty precyzyjne	503378	Do mikrodysekcji aorty.

detaliczny szt. powiedział: