Barwienie Calcofluor White: prosta metoda wizualizacji fluorescencji indukowanej promieniowaniem UV osadów celulozy w ścianach komórkowych skrawków łodyg roślin dwuliściennych

Streszczenie

Źródło: Pradhan M. et al. Barwienie histochemiczne drugorzędowych elementów ściany komórkowej Arabidopsis thaliana. J. Vis. Exp. (2014)

W tym filmie opisujemy procedurę barwienia w celu wizualizacji osadzania się celulozy w ścianach komórkowych Arabidopsis thaliana, rośliny dwuliściennej, przy użyciu bieli kalkofluorowej, która specyficznie wiąże się z β połączonymi glukanami, wykazując fluorescencję w świetle UV.

Protokół

1. Osadzanie trzonu

1. Przygotować 7% roztwór agarozy w wodzie (7 g agarozy do elektroforezy w 100 ml wody destylowanej). Rozpuścić agarozę w autoklawie przez 20 minut lub w kuchence mikrofalowej przez 20 minut przy najniższej intensywności (np. 10% intensywności w kuchence mikrofalowej o mocy 1 250 W).
2. Przygotuj domową formę do osadzania łodyg za pomocą plastikowych fiolek.
   1. Za pomocą żyletki odetnij stożkowe dno probówki mikrowirówkowej z nakrętką o pojemności 2 ml (część A). Za pomocą igły strzykawkowej przebić otwór w nasadce rurki nieco większy niż średnica trzpienia, który ma być osadzony. Następnie odetnij 0,5 cm od dna probówki do mikrowirówki o pojemności 0,6 ml (część B).
   2. Dodać odciętą 0,5 cm część probówki do mikrowirówki o pojemności 0,6 ml do wstępnie pokrojonej probówki do mikrowirówki o pojemności 2 ml. Uszczelnij obie części za pomocą Parafilmu (Rysunek 1).
      UWAGA: Dno probówki jest nacinane w celu ułatwienia usunięcia osadzonej próbki po zestaleniu się agarozy. Otwór w nasadce pomoże w utrzymaniu łodygi stabilnie, gdy łodyga jest osadzona w agarozie. Forma będzie służyć do przytrzymywania agarozy i utrzymywania łodygi prosto podczas osadzania. Parafilm utrzyma dwie części, A i B, aż agaroza zostanie zastygnięta, a łodyga osadzona.
   3. Za pomocą żyletki odetnij odcinek łodygi od obszaru zainteresowania (np. środka pierwszego międzywęźla łodygi).
      UWAGA: Idealnie byłoby, gdyby łodyga została przycięta tuż przed osadzeniem, aby uniknąć zniszczenia przez odwodnienie. Alternatywnie łodyga może być tymczasowo przechowywana na płytce zawierającej bibułę filtracyjną zwilżoną wodą. Płytkę tę można umieścić na lodzie, aż będzie gotowa do osadzenia, aby zapobiec odwodnieniu i deformacji tkanek. Przechowywanie łodygi przez okres dłuższy niż 30 minut bez dużej wilgotności spowoduje wyschnięcie łodygi.
3. Rozpuść agarozę w kuchence mikrofalowej o niskiej intensywności.
   UWAGA: Butelka zawierająca agarozę może być gorąca. Użyj rękawicy, aby podnieść butelkę. Pozostawić stopioną agarozę w temperaturze pokojowej (między 20 °C a 25 °C), aż ostygnie do około 50 °C.
4. Powoli odpipetować pipetą 5 ml agarozy do przygotowanej wcześniej plastikowej formy, aby napełnić fiolkę.
   UWAGA: Upewnij się, że w foremkach nie ma pęcherzyków powietrza. Pęcherzyki powietrza spowodują szczeliny w formie agarozy i nie pokryją całkowicie próbki łodygi, co ostatecznie doprowadzi do nierównego cięcia odcinków próbki.
   1. Pozwól agarozie ostygnąć przez 30 do 60 sekund, aby stała się półstała. Przetestuj małą wykałaczką, upewniając się, że może wniknąć i stanąć, ale nie unosić się w agarozie.
      UWAGA: Jeśli łodyga zostanie umieszczona, gdy agaroza jest jeszcze gorąca, uszkodzi próbkę, pomarszcząc łodygę, niszcząc morfologię komórki.
   2. Umieść łodygę w tej fiolce wypełnionej agarozą. Upewnij się, że trzpień pozostaje prosty. Umieść perforowaną nasadkę w taki sposób, aby końcówka trzpienia była przytrzymywana przez nasadkę. Nie przekręcaj zakrętki. Czasami więcej niż jedna łodyga (jednego rodzaju) może być osadzona w jednej fiolce; Ale w tym konkretnym przypadku nie używaj cap.
      UWAGA: Jeśli zakręcana nakrętka zostanie obrócona, trzpień zostanie skręcony.
5. Pozostawić fiolkę w temperaturze pokojowej lub w temperaturze 4 °C na 10-30 minut, aż stwardnieje.
6. Wyjmij formę, delikatnie wysuwając ją z tuby. Otwórz Parafilm. Delikatnie popchnij kciukiem spód części B formy, aby uwolnić zestaloną agarozę z części A na szklane szkiełko mikroskopowe.
7. Pokrój łodygę osadzoną w agarozie na trzy w przybliżeniu równe kawałki o długości 1,2 cm. Wytnij część łodygi, której nie było w agarozie i wyrzuć ją.
   1. Przechowuj te kawałki agarozy z osadzonymi łodygami w hermetycznych probówkach do mikrowirówek o pojemności 2 ml w ciemnym pudełku w temperaturze 4 °C, aż będą gotowe do podziału. Alternatywnie, probówki można przechowywać w temperaturze 4 °C maksymalnie przez tydzień.
      UWAGA: Przechowywanie jest możliwe, ale eksperymentator musi być świadomy, że osadzone łodygi są nadal żywe i, w zależności od eksperymentu, artefakty mogą potencjalnie zostać wprowadzone.

2. Cięcie trzonu

UWAGA: Przeczytaj uważnie instrukcję wibratomu i postępuj zgodnie ze wszystkimi instrukcjami bezpieczeństwa.

1. Upewnij się, że krążek z próbką jest czysty i całkowicie suchy (wolny od jakichkolwiek ciał stałych lub cieczy). Wyczyść krążek próbki żyletką, aby usunąć resztki kleju z poprzednich eksperymentów i umyj wodą. Następnie osusz ręcznikiem papierowym.
   UWAGA: Zapewni to, że klej będzie działał dobrze i zwiąże się z próbką agarozy. Jeśli ten krok nie zostanie wykonany prawidłowo, możliwe jest, że próbka może nie przylegać do krążka, a później spowoduje upadek próbki z dysku podczas cięcia.
   1. Użyj miękkich chusteczek papierowych, aby usunąć wilgoć z bloku agarozy zawierającego próbki.
   2. Umieść małą kroplę kleju tkankowego na krążku próbki. Rozprowadź klej, aby pokryć obszar na środku płytki, używając końcówki butelki z klejem. Szybko umieść blok agarozy tak, aby próbki były prostopadłe lub równoległe do płytki, odpowiednio dla przekrojów poprzecznych lub podłużnych. Pozwól klejowi przymocować próbkę do krążka próbki w temperaturze pokojowej lub w temperaturze 4 °C przez 10-30 min.
      UWAGA: Jest to krok, w którym zależy od czasu.
2. Zamocuj krążek z próbką na miejscu na tacy buforowej lub korycie. Blok agarozy wraz z sekcjami powinien być ustawiony równolegle do żyletki. Napełnij tackę buforową wodą destylowaną o temperaturze pokojowej, aż próbki zostaną całkowicie zanurzone.
3. Przetnij żyletkę na pół, a następnie przytnij końce solidnymi nożyczkami, aby ostrze pozostało całkowicie płaskie. Przymocuj połowę wstępnie przyciętej żyletki do uchwytu noża.
   1. Ustaw kąt na uchwycie noża na 84°, prędkość na 0,90 mm/s (pozycja 8 na wibratomie) i częstotliwość na 50 Hz (pozycja 5 na wibratomie). Cięte odcinki o grubości 100 μm. Użyj trybu ciągłego.
      UWAGA: Ta grubość została wybrana, aby zapewnić, że tkanka może wytrzymać różne zabiegi kwasowe i zasadowe stosowane w niektórych protokołach barwienia. Ustaw okno do cięcia i odczekaj 15-20 minut w trybie ciągłym, aby wibratom przeciął blok agarozy o długości około 1,2 cm.
4. Zebrać skrawki za pomocą jednorazowej plastikowej pipety podczas dzielenia na tacę buforową. Alternatywnie, skrawki można przenieść z tacki buforowej do szklanej zlewki, a następnie na przezroczystą płytkę Petriego. Przenieść kilka skrawków do probówek wirówkowych o pojemności 2,0 ml.
   UWAGA: Próbki są pobierane z płytki Petriego, ponieważ łatwiej jest zobaczyć skrawki na wyraźnym tle, a także dlatego, że tacę buforową można zagruntować pod następną próbkę.
5. Skrawki można przechowywać w probówce o pojemności 50 ml lub zbierać i przechowywać w probówkach do mikrowirówek o pojemności od 1,5 do 2 ml w temperaturze 4 °C przez 30 do 60 minut
   UWAGA: Przechowywanie sekcji przez dłuższy czas spowoduje niską jakość obrazu.

3. Białe barwienie kalkofluoru

1. Rozpuścić 0,02 g rozjaśniacza fluorescencyjnego 28 (calcofluor white M2R) w 10 ml wody destylowanej, aby przygotować 0,2% roztwór podstawowy. 0,2% roztwór może być przechowywany przez sześć miesięcy w ciemnej butelce w temperaturze 4 °C. Przygotować roztwór roboczy 0,02%, rozcieńczając 0,2% roztwór podstawowy 10x wodą destylowaną.
2. Przenieść sekcje trzpienia do probówki mikrowirówkowej o pojemności 2,0 ml. Dodać do probówki 1 ml 0,02% roztworu białka kalkofluorowego. Delikatnie odpipetować 0,02% roztwór białka kalkofluorowego w górę i w dół.
   UWAGA: Należy uważać, aby nie pipetować odcinków do końcówki pipety, ponieważ może to spowodować uszkodzenie sekcji.
   1. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut i powtórzyć pipetowanie. Inkubować sekcję przez kolejne 3 minuty w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: Pozwól, aby sekcje osiadły na dnie probówki, aby ułatwić odpipetowanie roztworu bez uszkadzania sekcji.
   2. Za pomocą pipety o pojemności 1 ml odciągnąć 700 μl 0,02% roztworu bieli kalkofluorowej i dodać 700 μl wody destylowanej; odczekać 5 minut, aby wypłukać roztwór białka kalkofluorowego. Powtórz pranie 3-4 razy. Należy użyć pipety o pojemności 1 ml z końcówką pipety przyciętą w taki sposób, aby można było łatwo odpipetować odcinki bez uszkodzenia.
   3. Delikatnie odpipetować skrawki do końcówki i na szkiełko mikroskopowe, a następnie przykryć je szkiełkiem nakrywkowym. Obserwuj sekcje w świetle UV.

Wyniki

Rysunek 1. Domowa forma do osadzania łodyg. Po lewej stronie; górna część zakręcanej probówki wirówkowej o pojemności 2 ml (część A) i spód probówki mikrowirówkowej o pojemności 0,6 ml (część B). Po prawej stronie; Parafilm zawierający dwie części; A i B, aby utworzyć ostateczną formę.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Agarozy	Wyłącznik elektromagnetyczny (EMD	MERC2125	Numer CAS: 9012-36-6
Rozjaśniacz fluorescencyjny 28/ Calcofluor White Stain	Sigma	F3543	Kwas 4,4'-bis[[4-[bis(2-hydroksyetylo)amino]-6-anilino-1,3,5-triazyno-2-ylo]amino]stilben-2,2'-disulfonowy [numer CAS 4404-43-7]
Wibratomizm	Księga Leica	Mikrotom Leica z ostrzem wibracyjnym VT1000S	http://www.leicabiosystems.com/products/sectioning/vibrating-blade-microtomes/details/product/leica-vt1000-s/
brzytwa	Amerykańska firma zajmująca się maszynkami do golenia	Pozycja # 60-0139-0000	Ostrze o podwójnej krawędzi ze stali nierdzewnej (Personna Super)
Probówki do mikrowirówek z nakrętką (2 ml)	Firma VWR	Numer katalogowy: 16466-044
Probówki do mikrowirówek (0,6 ml)	Axygen Scientific	MCT-060-C
Mitt	Bel-Art	380000000	SCIENCEWARE Rękawica ochronna na gorące dłonie
Klej do tkanek	Ted Pella Inc	Numer katalogowy 10033	Przechowywać w temperaturze 4 °C lub 20 °C przez 3 miesiące lub dłużej
kuchenka mikrofalowa	Panasonic	NN-SD762S	PELCO Pro CA 44 Klej tkankowy błyskawiczny
Okulary z mikro osłoną, kwadratowe, nr 1	Firma VWR	Numer telefonu 48366-067	22 x 22 mm (7/8 x 7/8")-Szkła nakrywkowe są odporne na korozję, jednolicie grube i płaskie. Grubość nr 1 wynosi od 0,13 do 0,17 mm.
Mikroszkiełka matowe, 1 mm	Firma VWR	Numer telefonu 48312-003	75 x 25 mm - 1 mm
Parafilm M	Opakowania z alkanu	BRNDPM998