Chromatografia cieczowa oddziaływań hydrofilowych: technika rozdzielania hydrofilowych analitów polarnych za pomocą kulek hydrofilowych

Streszczenie

Źródło: Liu, D., et al. Analiza N-glikanu immunoglobuliny G metodą ultrasprawnej chromatografii cieczowej. J. Vis. Exp. (2020).

Ten film demonstruje zasadę rozdzielania hydrofilowych związków polarnych za pomocą hydrofilowej chromatografii cieczowej. Technika ta pomaga w oczyszczaniu różnych analitów polarnych, w tym N-glikanów.

Protokół

1. Chromatografia oddziaływań hydrofilowych i analiza glikanów

1. Kondycjonowanie instrumentów UPLC i przygotowanie faz ruchomych
   1. Przygotuj fazy ruchome, w tym rozpuszczalnik A: 100 mM mrówczanu amonu (pH = 4,4), rozpuszczalnik B: 100% acetonitryl, rozpuszczalnik C: 90% ultraczysta woda (10% metanol) i rozpuszczalnik D: 50% metanolu (ultraczysta woda).
   2. Otwórz oprogramowanie, aby sterować fazami ruchomymi.
   3. Myć instrumenty UPLC przy natężeniu przepływu 0,2 ml/min (50% rozpuszczalnika B i 50% rozpuszczalnika C) równoważąc przez 30 minut, następnie przy natężeniu przepływu 0,2 ml/min (25% rozpuszczalnika A i 75% rozpuszczalnika B) równoważąc przez 20 minut, a następnie równoważąc natężenie przepływu 0,4 ml/min.
2. Rozpuścić N-glikany wstępnie znakowane 2-aminobenzamidem (2-AB) w 25 μl mieszaniny 100% acetonitrylu i ultraczystej wody w stosunku 2:1 (v/v). Następnie odwirować przy 134 × g przez 5 minut (4 °C) i załadować 10 μl znakowanych N-glikanów do przyrządów UPLC.
3. Oddzielić znakowane N-glikany przy natężeniu przepływu 0,4 ml/min z gradientem liniowym od 75% do 62% acetonitrylu przez 25 minut. Następnie należy przeprowadzić analizę za pomocą drabinki kalibracyjnej dekstranu/kolumny glikopeptydowej na UPLC w temperaturze 60 °C (w tym przypadku próbki przechowywano w temperaturze 4 °C przed wstrzyknięciem).
4. Wykrywanie fluorescencji N-glikanów przy długościach fal wzbudzenia i emisji odpowiednio 330 nm i 420 nm.
5. Zintegruj glikany w oparciu o pozycję piku i czas retencji.
6. Oblicz względną wartość każdego piku glikanu (GP) / wszystkich pików glikanu (GP) (procent, %) w następujący sposób: GP1: GP1 / GPs * 100, GP2: GP2 / GPs * 100, GP3: GP3 / GPs * 100 itd.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
2-aminobenzamid, 2-AB	Sigma, Chińska Republika Ludowa
Acetonitrylu	Huihai Keyi Technology Co., Ltd, Chiny
Mrówczan amonu	Pekin Minruida Technology Co., Sp. z o.o.
Drabinka do kalibracji dekstranu/kolumna glikopeptydowa	Watts technology Co., Ltd, Chiny
Moc 3.0	Waters technology Co., Ltd, Ameryka
Zestaw do etykietowania GlycoProfile 2-AB	Sigma, Chińska Republika Ludowa
metanol	Huihai Keyi Technology Co., Ltd, Chiny
Miernik wody czystej Milli-Q	Millipore Co., Ltd, Ameryka	202-2AB
Pistolet do przenoszenia płynów	Smer Fell Science and Technology Co., Ltd, Chiny	Zaleta A10
Lodówka niskotemperaturowa	Thermo Co., Ltd, Ameryka	PB-10 (wersja angielska)
Ultrasprawna chromatografia cieczowa	Watts technology Co., Ltd, Chiny
Pompa próżniowa	Watts technology Co., Ltd, Chiny	4672100, 0,5-10 μl i 10-100 μl oraz 20-200 μl i 1000 μl