$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Derywatyzacja fluorescencyjna kwasów sjalowych
- Przygotować 10 ml roztworu OPD, składającego się ze 100 mg o-fenylenodiaminy i 208 mg wodorosiarczynu sodu w 10 ml destylowanego H₂O.
- Dodać 20 μl roztworu OPD do próbek kwasu sjalowego. Wirować energicznie przez 30 s i inkubować próbki przez 4 godziny w temperaturze 80 °C w ciemności (tj. owinąć mikroprobówki folią aluminiową).
- Pozostawić próbki do ostygnięcia przez 5 minut, dodać 80 μl destylowanego H₂O i odwirować probówki przy 14 000 x g przez 1 min.
- Przenieść 80 μl z supernatantu do 300 μl fiolki HPLC o wysokim stopniu odzysku. Derywatyzowane próbki kwasu sjalowego można przechowywać w temperaturze 4-6 °C przez okres do jednego tygodnia.
2. Analiza HPLC pochodnych kwasu sjalowego
- Analizuj próbki za pomocą standardowego systemu HPLC podłączonego do detektora fluorescencyjnego online.
- Do analizy należy użyć kolumny C18 z odwróconą fazą o standardowych wymiarach 250 mm długości i 4,6 mm średnicy.
- Przygotować rozpuszczalnik A, rozcieńczając 200 ml roztworu podstawowego 800 ml wody klasy LCMS (LCMS - chromatografia cieczowa ze spektrometrią mas). Sam roztwór podstawowy można przygotować w następujący sposób:
- Dodać 46 g kwasu mrówkowego do 800 ml H₂O klasy LCMS.
- Doprowadzić pH do 4,5, dodając kroplami roztwór wodorotlenku amonu (puriss. p.a.).
- Przenieś rozpuszczalnik do cylindra miarowego i napełnij do 1 000 ml H₂O klasy LCMS. Ten roztwór podstawowy może być przechowywany w temperaturze 4-6 °C przez okres do 3 miesięcy.
- W przypadku rozpuszczalnika B należy użyć acetonitrylu klasy LCMS.
- Rozdzielić pochodne kwasów sjalowych przy natężeniu przepływu 1 ml/min z następującą elucją:
- Zacznij od dodania 10% rozpuszczalnika B zmieszanego z rozpuszczalnikiem A.
- Od 0 min do 15 min stopniowo zwiększaj udział rozpuszczalnika B z gradientem liniowym do 60%.
- Od 15 min do 16 min szybko zwiększ udział rozpuszczalnika B z gradientem liniowym od 60% do 90%. To inicjuje mycie kolumny HPLC.
- W celu dalszego przepłukania kolumny HPLC należy utrzymać poziom rozpuszczalnika B na poziomie 90% w okresie od 16 min do 18 min, a następnie stopniowo ponownie zmniejszać poziom rozpuszczalnika B do 10% między 18 min a 19 min.
- Ponownie wyrównać kolumnę HPLC do warunków początkowych 10% B między 19 a 24 min.
- Wstrzyknąć 50 μl próbki do systemu HPLC.
- Monitorować eluenty za pomocą detektora fluorescencji o długości fali wzbudzenia/emisji 373/448 nm, a derywatyzowanych kwasów sjalowych można oczekiwać w przybliżonych czasach retencji 9 min (dla Neu5Gc-OPD) i 10 min (dla Neu5Ac-OPD).
- Obliczyć względną ilość Neu5Gc (FNeu5Gc) z obszarów pików fluorescencji Neu5Ac (ANeu5Ac) i Neu5Gc (ANeu5Gc) w następujący sposób:
FNeu5Gc [%] = 100×ANeu5Gc/(ANeu5Ac+ANeu5Gc). W przypadku próbek mleka i wątroby od homozygotycznej myszy z nokautem Cmah FNeu5Gc powinien wynosić 0%, podczas gdy wartości dla FNeu5Gc myszy heterozygotycznych i dzikich mogą się znacznie różnić w zależności od wieku myszy i rodzaju tkanki (od 2% do >90%), przy oczekiwanym marginesie błędu ±12%.