Wysokosprawna chromatografia cieczowa z odwróconymi fazami: solidna metoda oznaczania ilościowego znakowanych fluorescencyjnie i derywatyzowanych kwasów sjalowych wyizolowanych z wątroby myszy

Abstract

Źródło: Cao, C. et al. Oznaczanie kwasów sjalowych w próbkach wątroby i mleka myszy typu dzikiego i CMAH z nokautem.J. Vis. Exp.(2017)

W tym filmie demonstrujemy wykrywanie kwasów sjalowych, kwasu N-acetyloneuraminowego i kwasu N-glikolylneuraminowego, za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej, HPLC, po derywatyzacji odpowiednim odczynnikiem do znakowania fluorescencyjnego, aby pomóc w wykrywaniu fluorescencji.

Protocol

1. Derywatyzacja fluorescencyjna kwasów sjalowych

1. Przygotować 10 ml roztworu OPD, składającego się ze 100 mg o-fenylenodiaminy i 208 mg wodorosiarczynu sodu w 10 ml destylowanego H₂O.
2. Dodać 20 μl roztworu OPD do próbek kwasu sjalowego. Wirować energicznie przez 30 s i inkubować próbki przez 4 godziny w temperaturze 80 °C w ciemności (tj. owinąć mikroprobówki folią aluminiową).
3. Pozostawić próbki do ostygnięcia przez 5 minut, dodać 80 μl destylowanego H₂O i odwirować probówki przy 14 000 x g przez 1 min.
4. Przenieść 80 μl z supernatantu do 300 μl fiolki HPLC o wysokim stopniu odzysku. Derywatyzowane próbki kwasu ....

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
chemikalia
Kwas N-acetyloneuraminowy	Sigma	Nr kat. A0812
Kwas N-glikolyloneuraminowy	Sigma	Numer katalogowy: 50644	1 mg podwielokrotności powinno być wystarczające
O-fenylenodiamina	Sigma	694975
Wodorosiarcun sodu	J&K Scientific Sp. z o.o	Numer telefonu 75234
Analiza HPLC
Fiolka HPLC o wysokim odzysku	Technologie Agilent	#5188-2788
System HPLC	Shimadzu powiedział:	Nexera
Detektor fluorescencyjny do HPLC	Shimadzu powiedział:	RF-20Osi
Kolumna HPLC	Fenomenex (fenomen)	Hiperklon ODS	Wymiary: 250 x 4,6 mm
Klasa LCMS H2O	Merck Millipore	#WX00011
Acetonitryl klasy LCMS	Merck Millipore	#100029	Hipergradacja
Roztwór wodorotlenku amonu	Przywra	#44273	Puriss. p.a.