Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Pomiar objętości embrionalnej za pomocą wyporności wody
UWAGA: W tym protokole używane są zarodki po 24 godzinach od zapłodnienia (hpf) (Rysunek 1). Zarodki użyte do pomiarów objętości nie są wykorzystane w analizie etanolu.
- Umieścić 10 zarodków i płyn pozazarodkowy w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml oznaczonej objętością 250 μl (ryc. 2A). Dodać wodę do linii napełniania o pojemności 250 μl (patrz próbka z barwioną wodą na rysunku 2B).
- Powtórz krok 1.1, aby ustawić pojemniki dla zarodków, z których usunięto kosmówkę.
- Aby usunąć kosmówkę, umieść zarodki w ich kosmówce na 100-milimetrowej szalce Petriego z 2 mg/ml koktajlu proteazy w pożywce dla zarodków w temperaturze pokojowej (RT) przez 10 minut. Co kilka minut delikatnie obracaj zarodki, aby przerwać kosmówkę.
- Gdy wszystkie zarodki są wolne od kosmówki, usunąć zarodki pozbawione kosmówki z koktajlu proteazy/pożywki zarodkowej i umieścić na nowej szalce Petriego o średnicy 100 mm ze świeżą pożywką zarodkową w celu umycia zarodków. Powtórz ten krok prania jeszcze 1 raz (w sumie 2 prania). Przenieś zarodki na świeżą szalkę Petriego o średnicy 100 mm.
- Używając możliwie najmniejszej końcówki i bez uszkadzania zarodków, ostrożnie usuń cały płyn z okolic zarodków za pomocą mikropipetora p200 (ryc. 2C) i zważ wodę na wadze z dokładnością <0,1 mg. Aby określić objętość próbki 10 zarodków, odejmij masę/objętość pobranej wody (1 ml wody = 1 g wody) od 250 μl. Aby określić objętość pojedynczego zarodka, podziel różnicę między 250 μl a wagą usuniętej wody przez 10,
2. Leczenie embrionów etanolem
- Zebrać zarodki ze zbiorników godowych i umieścić na standardowej szalce Petriego o średnicy 100 mm. Odliczyć nie więcej niż 100 zarodków na pojedynczą szalkę Petriego i inkubować w temperaturze 28,5 °C.
nuta: Jeśli kosmówka ma zostać usunięta (krok 1.2), należy ją usunąć przed dodaniem etanolu.
- Przy 6 hpf dodać do 100 zarodków na nową, standardową szalkę Petriego o średnicy 100 mm z pożywką dla zarodków lub pożywką dla zarodków + 1% etanolu (v/v). Przykryj, ale NIE uszczelniaj szalki Petriego. Umieścić zarodki w inkubatorze niskotemperaturowym ustawionym na temperaturę 28,5 °C na 18 godzin lub do momentu, gdy zarodki osiągną punkt czasowy rozwoju wynoszący 24 hpf.
3. Przygotowanie przepływu pracy przed przetwarzaniem zarodków do chromatografii gazowej w przestrzeni głowy
- Przygotować roztwór 5 M NaCl w wodzie (potrzebne będzie 450 μl na probówkę z próbką), aby zdenaturować wszystkie białka i zapobiec metabolizmowi etanolu. Przygotować koktajl proteazy w stężeniu 2 mg/ml w pożywce zarodkowej.
- Oznaczyć 1,5 ml probówki mikrowirówkowej i fiolkę chromatografu gazowego o pojemności 2 ml dla każdej próbki. Oznaczyć dodatkowe fiolki do chromatografu gazowego o pojemności 2 ml dla wzorców etanolu opisanych poniżej, a także powietrze, wodę i ślepe próby koktajlu 5 M NaCl/proteazy.
- Ustawić trzy mikropipety p200, dwie ustawione na 50 μl, a trzeci zestaw na 200 μl; mikropipetor p1000 ustawiony na 450 μl i mikropipetor p2 ustawiony na 2 μl. W przypadku szklanych pipet używanych do przenoszenia zarodków z szalek Petriego do probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml należy szybko przepuścić końcówkę pipety przez płomień, aby wygładzić krawędzie i nie uszkodzić zarodków podczas wciągania ich do pipety.
4. Przetwarzanie embrionów do chromatografii gazowej w przestrzeni głowy
UWAGA: Zarówno zarodki w ich kosmówkach, jak i te wcześniej usunięte z ich kosmówek są traktowane tak samo dla spójności w obliczaniu współczynników rozcieńczenia.
- Używając dwóch mikropipetorów p200 ustawionych na 50 μl, narysuj 50 μl roztworu koktajlu proteazy do jednego i wciągnij 50 μl wody do drugiego.
- Za pomocą szklanej pipety i mikropipetora szybko umieść 10 zarodków (z kroku 2.2) w probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml i zamknij nakrętkę (jak opisano na rysunku 2A). Powtórz tę czynność dla wszystkich próbek, które mają być badane, kontroli i zarodków poddanych działaniu etanolu.
- Używając mikropipetora p200 ustawionego na 200 μl, szybko otwórz nakrętkę i usuń wszystkie resztki pożywki z zarodków (jak opisano na rysunku 2C). Szybko umieść pipetę zawierającą 50 μl wody w probówce i szybko, ale delikatnie (aby nie uszkodzić zarodków) dodaj, a następnie usuń wodę. Szybko dodać 50 μl roztworu koktajlu proteazy z pipety oczekującej i zamknąć nakrętkę probówki (Rysunek 2D).
nuta: Wykonuj ten proces pojedynczo próbkę.
- Pozostaw próbkę w temperaturze pokojowej przez 10 minut, aby koktajl proteazy mógł zdegradować kosmówkę. Następnie szybko dodaj 450 μl 5 M NaCl i zamknij nakrętkę probówki (rysunek 2E). Wirować próbki przez 10 minut. Aby przyspieszyć proces, ustaw mieszalnik tak, aby wirował wiele próbek w tym samym czasie.
UWAGA: Dodaj niewielką ilość (~100 μL) mieszanki kulek krzemionkowych (2 rozmiary, kulka 0,5 mm i 1 mm) do dowolnej probówki z zarodkami starszymi niż 24 hpf. U starszych zarodków struna grzbietowa pozostanie nienaruszona niezależnie od tego, jak długo są one homogenizowane.
- Po homogenizacji przez 10 minut szybko usunąć 2 μl homogenizowanego supernatantu z zarodków i dodać do fiolki z chromatografem gazowym. Szybko zamknąć fiolkę nakrętką z politetrafluoroetylenu.
5. Przygotowanie roztworów do produkcji mediów i etanolu
- Aby przygotować wzorce pożywki, należy rozcieńczyć pożywkę 10-krotnie roztworem koktajlu 5 M NaCl/proteaza. Dodać 2 μl każdej próbki do fiolki z chromatografem gazowym i zamknąć pokrywą z politetrafluoroetylenu.
- Aby przygotować wzorce etanolu, należy utworzyć seryjne rozcieńczenie 100% etanolu w 5 M roztworze koktajlu NaCl/proteazy do następujących stężeń: 0,3125, 0,625, 1,25, 2,5, 5, 10, 20 i 40 mM. Dodać po 2 μl każdego wzorca do fiolki z chromatografem gazowym i zamknąć nasadką z politetrafluoroetylenu.
6. Przygotowanie chromatografii gazowej w przestrzeni głowy
UWAGA: Chromatografia gazowa w przestrzeni głowy jest używana do ilościowego określania poziomu etanolu, a nie do separacji.
- Ustaw grzałkę automatycznego podajnika próbek na 58 °C i włącz. Pozwól, aby grzałka osiągnęła temperaturę 58 °C i włącz przewody powietrza i wodoru gazowego zasilające chromatograf gazowy (do jonizacji płomieniowej używanej do ilościowego oznaczania etanolu).
UWAGA: Psi powinno być ustawione tak, aby chromatograf działał prawidłowo zgodnie ze specyfikacjami producenta. Upewnij się, że przewód helu jest włączony i ustawiony na odpowiednie psi.
- W przypadku przegrody należy upewnić się, że liczba wstrzykiwanych próbek nie wynosi >100. W przypadku włókna iniekcyjnego upewnij się, że liczba wstrzykniętych próbek nie wynosi >500.
UWAGA: Jeśli którykolwiek z nich przekracza liczbę wstrzyknięć, należy je zmienić przed uruchomieniem próbek testowych.
- Włącz oprogramowanie analityczne i upewnij się, że stacja robocza jest prawidłowo skonfigurowana. Przechowuj wszystkie dane zgodnie ze standardami laboratorium/działu. Utwórz nową listę próbek dla próbek, które mają zostać uruchomione.
- Zainicjuj metodę uruchamiania i poczekaj, aż detektor płomieniowo-jonizacyjny ustabilizuje się przed uruchomieniem próbek. Po ustabilizowaniu uruchom metodę uruchamiania oprogramowania, aby wyczyścić światłowód.
7. Pomiary próbek za pomocą chromatografii gazowej w przestrzeni czołowej
- Po zakończeniu metody uruchamiania utwórz 1 nowy wiersz na próbkę na liście próbek. Z menu metod w oprogramowaniu do analizy załaduj 436 Prąd spme etanol 2013 3min absorbować 2_5min rg bieg. METH dla każdej próbki z listy próbek.
- Wypełnij listę próbek, zaczynając od powietrza, wody, 5 M półfabrykatów koktajlu NaCl/proteazy. Następnie wprowadź normy w kolejności, od 0,3125 do 40 mM. Postępuj zgodnie z normami z drugą rundą półfabrykatów koktajlowych powietrze, woda i 5 M NaCl/proteaza.
- Wprowadzić wszystkie homogenizowane próbki supernatantu zarodka do badania, od najniższego do najwyższego przewidywanego stężenia etanolu. Zakończ wchodząc w trzecią i ostatnią rundę półfabrykatów koktajlu powietrza, wody i 5 M NaCl/proteazy.
- Dodać fiolki z chromatografem gazowym do automatycznego podajnika próbek w kolejności, w jakiej próbki zostały wprowadzone. Pozostaw próbki do ogrzania przez 10–15 minut. Uruchom przykładowe przebiegi w oprogramowaniu.
- Po uruchomieniu wszystkich próbek i końcowych półfabrykatów aktywuj metodę zamykania w oprogramowaniu, dodając końcową próbkę do listy próbek i uruchamiając tryb wstrzymania. METAMFETAMINA. Utwórz kopię zapasową wszystkich danych uzyskanych podczas próbnych przebiegów. Wyłącz urządzenie w następującej kolejności: grzałka automatycznego podajnika próbek, zbiornik wodoru i dopiero gdy temperatura chromatografu osiągnie 30 °C, zbiornik powietrza. Pozostaw zbiornik helu włączony, aby zachować kolumnę wosku.
8. Integracja piku etanolu w próbce i analiza stężenia próbki
UWAGA: Wszystkie wartości od 8.3 zostały obliczone w pliku Excel, który wszystkie równania zostały wstępnie wypełnione.
- Po zakończeniu metody wyłączania kliknij Otwórz chromatogram. Otwórz folder zawierający wyniki. Próbki są automatycznie integrowane z tym programem.
- W wynikach upewnij się, że zostały zintegrowane właściwe piki (piki etanolu od 2 do 2,5). Po potwierdzeniu wszystkich próbek wydrukuj lub wyeksportuj wyniki.
- Wykreślić na wykresie wysokość piku wzorców etanolu. Obliczyć nachylenie, punkt przecięcia z osią Y i wartości R2 dla wzorców etanolu (R2 powinien wynosić >0,99).
nuta: Wartości te zostaną wykorzystane do określenia stężenia etanolu na podstawie wysokości piku próbki.
- Dla każdej próbki należy odjąć wysokość piku próbki od punktu przecięcia Y wzorców etanolu. Podzielić tę wartość przez nachylenie wzorców etanolu, aby uzyskać wartość etanolu dla każdej próbki w fiolkach GC.
- Aby obliczyć stężenie etanolu w zarodkach, należy najpierw obliczyć współczynnik rozcieńczenia dla każdej próbki. Weź pomiar objętości obliczony w kroku 1.3 niniejszego protokołu i podziel go przez pomiar objętości plus 500 μl. Odpowiada to 5 M roztworowi koktajlu NaCl/proteazy dodawanemu do każdej próbki podczas przetwarzania zarodków (etapy 4.3 i 4.4).
- Stosując ten współczynnik rozcieńczenia próbki, pomnożyć przez wartość etanolu w próbce dla każdej próbki. Wyniki będą w stężeniu mM. Obliczyć próbki referencyjne pożywki, mnożąc wartość alkoholu etylowego w pożywce przez współczynnik rozcieńczenia 10,
