Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym: technika analityczna do wykrywania siarczanów heparanu o różnej długości łańcucha wyizolowanych z tkanki płucnej myszy

Streszczenie

Źródło: LaRiviere, W. B. et al., Wykrywanie glikozaminoglikanów za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym i barwienia srebrem. J. Vis. Exp. (2021)

Ten film demonstruje procedurę separacji siarczanów heparanu wyizolowanych z tkanki płucnej myszy za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym.

Protokół

1. Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym izolowanych i oczyszczanych glikozaminoglikanów

1. Przygotować wcześniej roztwory niezbędne do elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (PAGE) (Tabela 1).
   nuta: Wybrać procentową zawartość akrylamidu w roztworze żelu do rozdzielczości w zależności od wielkości glikozaminoglikanów, które mają znajdować się w próbce. 15% jest zalecane do rozpuszczania większych fragmentów (o długości większej niż 30 podjednostek disacharydowych); 22% dla mniejszych fragmentów (o długości <20 podjednostek disacharydowych).
2. Umieść pustą kasetę w zbiorniku PAGE. Odlej żel rozdzielczy w następujący sposób: W probówce o pojemności 15 ml wymieszaj 10 ml roztworu żelu rozdzielczego, 60 μl 10% nadsiarczanu amonu (musi być świeżo przygotowany) i 10 μl TEMED (dodać TEMED na końcu). Delikatnie odwróć rurkę 2-3x. Użyj pipety, aby szybko dodać powyższe 10 ml roztworu do kasety. Nałożyć 2 ml dejonizowanej, przefiltrowanej wody i pozostawić rozdzielczy żel do polimeryzacji przez 30 minut.
   nuta: Poniższy protokół PAGE został zoptymalizowany dla pionowego systemu PAGE przy użyciu kaset odlewniczych o wymiarach 13,3 x 8,7 cm (szerokość x długość) o grubości 1,0 mm i łącznej objętości około 12 ml. Można stosować inne systemy kasetowe, ale mogą wymagać optymalizacji przez użytkownika końcowego.
3. Po pełnej polimeryzacji żelu rozdzielczego należy wylać nałożoną wodę i odlać żel do układania w stos w następujący sposób: w probówce o pojemności 15 ml wymieszać 3 ml roztworu żelu do układania w stos, 90 μl 10% nadsiarczanu amonu (musi być świeżo przygotowany), 3 μl TEMED (dodać TEMED na końcu).
4. Delikatnie odwróć rurkę 2-3x. Za pomocą pipety szybko dodaj roztwór żelu do układania w stos na zestalony żel rozdzielczy; napełnij kasetę po brzegi. Całkowicie włóż grzebień dołączony do zestawu. Pozostawić żel do polimeryzacji żelu do układania na 30 minut.
5. Po polimeryzacji żelu upewnij się, że pasek taśmy został usunięty z dna kasety i umieść kasetę z powrotem w zespole zbiornika PAGE.
6. Napełnij górną i dolną komorę odpowiednio buforem górnej i dolnej komory.
7. Wysuszone próbki z kroku 1.11.4 rozpuścić w minimalnej niezbędnej objętości dejonizowanej, przefiltrowanej wody (co najwyżej 50% objętości studzienek w żelu PAGE). Wymieszać w stosunku 1:1 z buforem ładującym próbkę. Załadować próbki i "drabinki" oligosacharydowe HS (patrz tabela 1) do żelu.
8. Uruchom żel przez 5 minut przy napięciu 100 V. Następnie uruchom żel pod napięciem 200 V przez 20-25 minut (dla żelu rozdzielczego 15% poliakryloamidu), 40-50 minut (dla żelu rozdzielczego 18% poliakryloamidu), 90-100 minut (dla żelu rozdzielczego 22% poliakryloamidu).
   nuta: Konieczna może być pewna optymalizacja czasu pracy 200 V. Czerwień fenolowa migruje przed oligosacharydami heparyny, które mają długość 2 podjednostek polimeru (tj. stopień polimeryzacji 2 lub dp2); Błękit bromofenolowy migruje przed DP10-DP14. Najlepsze wyniki uzyskuje się, gdy napięcie jest przyłożone w taki sposób, że czerwony prążek fenolowy migruje prawie, ale nie całkiem, na dno żelu. Dostosuj odpowiednio czas pracy.

Wyniki

Tabela 1: Roztwory wymagane do elektroforezy w żelu poliakrylamidowym oczyszczonych glikozaminoglikanów. Wszystkie roztwory należy przefiltrować (0,22 μm) przed użyciem.

UWAGA: Wszystkie roztwory muszą być przefiltrowane (0,22μm) przed użyciem.
rozwiązanie	przepis	komp...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Nadsiarczan amonu (stały)	ThermoFisher Naukowy	Zobacz materiał BP179-25	Stopień elektroforezy
System oczyszczania wody Barnstead GenPure Pro	ThermoFisher Naukowy	10-451-217PKG	Każdy system dejonizacji/oczyszczania wody jest dopuszczalnym substytutem
Kwas borowy (stały)	ThermoFisher Naukowy	A73-500	Klasa biologii molekularnej
Błękit bromfenolowy (w postaci stałej)	ThermoFisher Naukowy	Zobacz materiał B392-5
Kryterium pusta kaseta do PAGE (grubość 1,0 mm, 12+2 dołki)	Bio-Rad	3459901	Wystarczy dowolny system kaset odlewniczych PAGE o grubości 1,0 mm
Criterion PAGE System komórkowy (ogniwo i zasilacz)	Bio-Rad	1656019	Sprawdzi się każdy porównywalny pionowy system żelowy PAGE)
Sól disodowa EDTA (stała)	ThermoFisher Naukowy	Numer katalogowy: 02-002-786	Klasa biologii molekularnej
Glicyna (ciało stałe)	ThermoFisher Naukowy	G48-500	Stopień elektroforezy
Kwas solny (ciecz)	ThermoFisher Naukowy	A466-250
N,N'-metyleno-bis-akryloamid (w postaci stałej)	ThermoFisher Naukowy	Zobacz materiał BP171-25	Stopień elektroforezy
Czerwień fenolowa (stała)	ThermoFisher Naukowy	Zobacz materiał P74-10	Wolny kwas
Sacharoza (stała)	ThermoFisher Naukowy	Zobacz materiał BP220-1	Klasa biologii molekularnej
TEMED (N,N,N',N'-tetrametylenodiamina)	ThermoFisher Naukowy	Zobacz materiał BP150-20	Stopień elektroforezy
Podstawa Tris (solidna)	ThermoFisher Naukowy	Zobacz materiał BP152-500	Klasa biologii molekularnej
Filtr próżniowy, jednorazowego użytku, PES o porach 0,22 uM, objętość 500 ml	ThermoFisher Naukowy	569-0020	Dopuszczalne alternatywne objętości i materiały filtracyjne
Akrylamid (stały)	ThermoFisher Naukowy	Zobacz materiał BP170-100	Stopień elektroforezy
Dekaszaryd pochodzący z heparyny (dp10)	Galen naukowy	Sonda HO10
Heksazacharda pochodząca z heparyny (dp6)	Galen naukowy	HO06
Oligosacharydy pochodzące z heparyny (dp20)	Galen naukowy	Sonda HO20

TGL powiedział: powiedział: