Elektroforeza w żelu poliakryloamidowym z dodecylosiarczanem sodu do analizy białek: technika oddzielania i wizualizacji białek na podstawie masy cząsteczkowej

Streszczenie

Źródło: Sultana, S. et al. Ekstrakcja i wizualizacja agregatów białkowych po leczeniu Escherichia coli za pomocą stresora proteotoksycznego. J. Vis. Exp. (2021).

Ten film demonstruje technikę denaturacji białek na bazie poliakrylamidu. Technika ta pomaga we wstępnej identyfikacji białek na podstawie ich mas cząsteczkowych.

Protokół

1. Separacja i wizualizacja wyekstrahowanych agregatów białkowych za pomocą SDS-PAGE

1. Przygotuj 12% żel poliakryloamidowy SDS
   1. W przypadku dwóch żeli separujących należy odpipetować 5,1 ml podwójnie destylowanej wody (ddH₂O), 3,75 ml Tris-HCl (pH 8,8), 7,5 ml 20% (w/v) SDS, 6 ml 30% roztworu akryloamidu/bisakryloamidu (29:1), 75 ml 10% w/v nadsiarczanu amonu i 10 ml tetrametyloetylenodiaminy (TEMED) do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i delikatnie wymieszać bez wprowadzania pęcherzyków powietrza. Wlać żel za pomocą pipety o pojemności 1 ml do szklanych płytek, pozostawiając górne 2 cm wolne od mieszanki. Dodaj 70% etanolu na wierzch żelu separującego i zapewnij równomierne połączenie między dwiema warstwami.
   2. Po polimeryzacji żelu rozdzielającego należy przygotować żel do układania w stos, pipetując 1,535 ml ddH₂O, 625 ml Tris-HCl (pH 6,8), 12,5 ml 20% (w/v) SDS, 335 ml 30% roztworu akryloamidu/bisakryloamidu (29:1), 12,5 ml 10% w/v nadsiarczanu amonu i 2,5 ml TEMED. Usunąć etanol z żeli rozdzielających i dodać roztwór żelu do układania w stosy. Włóż grzebień z żądaną liczbą kieszeni bez wprowadzania pęcherzyków powietrza. Pozostawić polimeryzację na 20-30 minut.
2. Załadować 4 μl każdej próbki i drabinki białkowej do oddzielnych studzienek i uruchomić żel(e) w buforze Tris-Glycine (Tabela 1) pod napięciem 144 V przez 45 minut w temperaturze pokojowej.
   nuta: Zatrzymaj żel, gdy pasmo bromofenolu ma zamiar wydostać się z żelu.
3. Zabarwić żel(e) we wstępnie podgrzanym roztworze Fairbanks A (Tabela 1) przez 30 minut na bujaku.
4. Odbarwić żel(e) we wstępnie podgrzanym roztworze Fairbanks D (Tabela 1) do uzyskania pożądanego tła (np. przez noc) na bujaku.

Wyniki

Rozwiązania	Przepisy
Bufor A	10 mM fosforan potasu (pH 6,5), 1 mM EDTA
Bufor B	Bufor A zawierający 2% nonidetu P-40. Może być przechowywany w temperaturze pokojowej do późniejszego wykorzystania.
Fairbanks A (roztwór do barwienia)	25% izopropanol, 10% lodowaty kwas octowy,...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Chemikalia/odczynniki
aceton	Fisher Naukowy	67-64-1
30% roztwór akryloamidu/bisakryloamidu 29:1	Bio-Rad	1610156
Nadsiarczan amonu	Millipore Sigma	A3678-100G
Bluestain 2 Drabinka białkowa, 5-245 kDa	Złota biografia	Zobacz materiał P008-500
β-merkaptoetanol	Millipore Sigma	Silnik M6250-100ML
Błękit bromofenolowy	Złota biografia	B-092-25
Coomassie Błękit Brylantowy R-250	MP Biomedicals Sp. z o.o	821616
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)	Sigma-Aldrich	SLBT9686
Lodowaty kwas octowy	Millipore Sigma	ARK2183-1L
Glicerol, 99%	Sigma-Aldrich	G5516-1L
glicyna	Złota biografia	G-630-1
Izopropanol (2-propanol)	Sigma	402893-2,5 l
10x bufor MOPS	Teknova	Zobacz materiał M2101
Dodecylosiarczan sodu (SDS)	Sigma-Aldrich	L3771-500G
Tetrametyloetylenodiamina (TEMED)	Millipore Sigma	T9281-50ML
Baza Tris	Złota biografia	T-400-1
Materiał/Wyposażenie
zasilacz	ThermoFisher Naukowy	EC105
Rocker	Alkalia Naukowe	Złącze RS7235
Mały szklany talerz	Bio-Rad	1653311
Płytki dystansowe (1 mm)	Bio-Rad	1653308
Spektrofotometr	Termonaukowy	3339053
Wirówka stołowa do probówek wirówkowych o pojemności 15 ml	Beckman-Coulter
Pionowa komora do elektroforezy żelowej	Bio-Rad	1658004
Wirownik	Fisher Vortex Genie 2	Numer katalogowy: 12-812
Mieszalnik termiczny	Benchmark naukowy	H5000-HC
Grzebień z 10 dołkami	Bio-Rad	1653359

TGL . powiedział: