Denaturacja elektroforezy w żelu poliakryloamidowym mocznika do analizy RNA: technika oddzielania fluorescencyjnie znakowanych fosforylowanych oligonukleotydów RNA od ich niefosforylowanych odpowiedników

Streszczenie

Źródło: Pillon, M. C., et al., Nonradioactive Test to Measure Polynucleotide Phosphorylation of Small Nucleotide Substrates. J. Vis. Exp. (2020)

W tym filmie demonstrujemy elektroforezę w żelu poliakrylamidowym do denaturacji w celu oddzielenia fosforylowanych gatunków RNA od ich niefosforylowanych odpowiedników. Gatunki RNA są znakowane fluorescencyjnie w celu detekcji laserowej na żelu.

Protokół

1. Elektroforeza żelowa

1. Przygotować 15% roztwór żelu akrylamidowego/8 M mocznika.
   ostrożność: Z akrylamidem należy obchodzić się ostrożnie, ponieważ jest to neurotoksyna. Podczas obchodzenia się z nim zawsze noś rękawice, fartuch laboratoryjny i okulary.
   1. W szklanej zlewce o pojemności 150 ml wymieszaj 22,5 ml wstępnie zmieszanego 40% roztworu akrylamidu/bis-akrylamidu 29:1, 6 ml 10x TBE, 28,8 g mocznika i wody wolnej od RNaz do całkowitej objętości 59 ml. Delikatnie wymieszaj roztwór.
      nuta: W zależności od długości substratu RNA, zmiana procentowej zawartości poliakrylamidu może....

Wyniki

Figure 1: Przykład analizy żelu denaturującego fosforylowanego RNA. Test in vitro kinazy RNA Las1-Grc3 (110 nM) inkubowany z 500 nM SC-ITS2 RNA. X oznacza reakcję kontrolną bez Las1-Grc3, a trójkąt reprezentuje miareczkowanie ATP w zakresie 0-10 mM. C2 RNA jest wynikiem rozszczepienia.......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Grzebień 34-dołkowy 0,4 mm	Przedsiębiorstwo BioRad	1653848
Podkładka dystansowa 0,4 mm	Przedsiębiorstwo BioRad	1653812
0,5 M EDTA ph 8,0	Firma KD Medical	Przekaźnik RGF-3130
1M chlorek magnezu	Firma KD Medical	CAC-5290 (wersja cAC-5290
1M Tris pH 8,0	Firma KD Medical	Kontroler RGF-3360
40% akrylamid/bis roztwór 29:1	Przedsiębiorstwo BioRad	1610146
5M Chlorek sodu	Firma KD Medical	Przekaźnik RGF-3720
nadsiarczan amonu (APS)	Przedsiębiorstwo BioRad	Numer katalogowy: 161-0700
Atp	Sigma	A2383-1G
Kwas borowy	Sigma	Zobacz materiał B0394
Sól sodowa błękitu bromofenolowego	Sigma	B5525-5G
Talerze szklane	Thomas Naukowy	Numer katalogowy: 1188K51
Sekwencer Hoefer SQ3	Hoefer	N/a
Oprogramowanie Image J	N/a	N/a	https://imagej.nih.gov/ij/
Znakowane oligonukleotydy RNA	Identyfikator IDT	Na zamówienie
Zasilacz Pharmacia EPS 3500	Farmacja	N/a
Filtr Steriflip 0. 22 um	Milipory	5FCP00525
TEMED	Przedsiębiorstwo BioRad	161-0800
Baza Tris	Sigma	TRIS-RO
Imager żelowy Typhoon FLA 9500	GE Opieka zdrowotna	N/a
Ultra czysta woda DEPC	Invitrogen	750023
Ultra czysty glicerol	Invitrogen	Numer katalogowy: 19E1056865
mocznik	Fisher Chemiczny	U15-500

) powiedział: TGL TGL