Denaturacja elektroforezy w żelu poliakryloamidowym mocznika do analizy RNA: technika oddzielania fluorescencyjnie znakowanych fosforylowanych oligonukleotydów RNA od ich niefosforylowanych odpowiedników

Streszczenie

Źródło: Pillon, M. C., et al., Nonradioactive Test to Measure Polynucleotide Phosphorylation of Small Nucleotide Substrates. J. Vis. Exp. (2020)

W tym filmie demonstrujemy elektroforezę w żelu poliakrylamidowym do denaturacji w celu oddzielenia fosforylowanych gatunków RNA od ich niefosforylowanych odpowiedników. Gatunki RNA są znakowane fluorescencyjnie w celu detekcji laserowej na żelu.

Protokół

1. Elektroforeza żelowa

1. Przygotować 15% roztwór żelu akrylamidowego/8 M mocznika.
   ostrożność: Z akrylamidem należy obchodzić się ostrożnie, ponieważ jest to neurotoksyna. Podczas obchodzenia się z nim zawsze noś rękawice, fartuch laboratoryjny i okulary.
   1. W szklanej zlewce o pojemności 150 ml wymieszaj 22,5 ml wstępnie zmieszanego 40% roztworu akrylamidu/bis-akrylamidu 29:1, 6 ml 10x TBE, 28,8 g mocznika i wody wolnej od RNaz do całkowitej objętości 59 ml. Delikatnie wymieszaj roztwór.
      nuta: W zależności od długości substratu RNA, zmiana procentowej zawartości poliakrylamidu może poprawić rozdzielczość między nieufosforylowanym a ufosforylowanym RNA.
   2. Aby rozpuścić mocznik, podgrzej roztwór w kuchence mikrofalowej przez 20 s, wymieszaj płyn i natychmiast umieść roztwór z powrotem w kuchence mikrofalowej na kolejne 20 sekund. Delikatnie mieszaj roztwór, aż mocznik całkowicie się rozpuści.
   3. Powoli schłodzić roztwór, umieszczając szklaną zlewkę w płytkiej łaźni wodnej zawierającej zimną wodę. Upewnij się, że poziom zimnej wody otaczającej szklaną zlewkę jest wyższy niż poziom roztworu wewnątrz szklanej zlewki. Będzie to sprzyjać efektywnemu przenoszeniu ciepła. Czekamy 5 min.
      nuta: Nie należy kontynuować stosowania tego protokołu, jeśli szklana zlewka jest ciepła; temperatura wody powinna być niższa niż 25 °C. Jeśli po 5 minutach nadal jest ciepły, zastąp wodę w łaźni wodnej świeżą zimną wodą i odczekaj kolejne 5 minut.
   4. Przefiltruj i odgazuj roztwór za pomocą jednorazowej jednostki filtrującej 0,22 μm w celu usunięcia cząstek stałych i mikroskopijnych pęcherzyków powietrza.
2. Wlej żel denaturujący
   1. Użyj mydła i ciepłej wody do czyszczenia krótkiej i długiej szklanej płytki przeznaczonej do żeli o wymiarach całkowitych 31,0 cm x 38,5 cm. Spryskaj każdą szklaną płytkę 95% etanolem i wytrzyj szkło, aby usunąć wilgoć.
      nuta: Jedna z dwóch płytek może być silikonowana, aby zapobiec uszkodzeniu żelu podczas oddzielania kanapki ze szklaną płytą. Jednak ten krok nie jest konieczny, ponieważ protokół ten ma na celu wizualizację RNA bez oddzielania szklanych płytek.
   2. Umieść długą szklaną płytkę poziomo na pudełku, tak aby była podniesiona z blatu.
      ostrożność: Akrylamid jest toksyczny, dlatego stacja nalewania żelu musi być pokryta papierem stołowym, który może wchłonąć rozlaną ciecz i natychmiast po zakończeniu procedury zostać umieszczona w worku na odpady.
   3. Umieść czystą przekładkę 0.4 mm wzdłuż długich krawędzi długiej szklanej płyty.
   4. Połóż krótką szklaną płytkę na długiej płycie i upewnij się, że krawędzie krótkiej płytki, długiej płytki i przekładek są wyrównane. Zaciśnij każdą stronę za pomocą trzech równomiernie rozmieszczonych metalowych zacisków.
   5. Dodać 24 μl TEMED do 15% roztworu akryloamidu/8 M mocznika przygotowanego w kroku 3.1 i wymieszać roztwór.
   6. Dodać 600 μl 10% (w/v) APS do roztworu w kroku 1.2.5 i delikatnie wymieszać roztwór.
   7. Natychmiast wlej roztwór między szklane płytki.
      nuta: Aby uniknąć pęcherzyków, postukaj w szklankę podczas nalewania roztworu.
   8. Ostrożnie dodaj czysty, 32-dołkowy grzebień o średnicy 0,4 mm na wierzch kanapki ze szklaną płytą.
   9. Odczekaj co najmniej 30 minut, aby akrylamid uległ polimeryzacji.
3. Uruchom żel denaturujący
   1. Ustawić blok grzewczy na 75 °C.
   2. Zdejmij metalowe clamps przytrzymujące kanapkę ze szklaną płytą razem i dokładnie umyj i osusz kanapkę ze szklaną płytą.
   3. Umieść kanapkę ze szklaną płytką w aparacie żelowym z krótką płytką skierowaną do wewnątrz.
   4. Przygotuj 0,5 x TBE bufor do biegania, łącząc 100 ml 10 x TBE z 1,9 l wody wolnej od RNaz. Dodać 600 ml buforu do górnej i dolnej komory aparatu żelowego.
   5. Delikatnie wyjmij grzebień i dokładnie wypłucz studzienki za pomocą strzykawki. UWAGA: Ten krok ma kluczowe znaczenie dla usunięcia mocznika ze studzienek.
   6. Uruchom żel przez 30 minut przy 50 W. Voltage wynosi około 2,000 V. UWAGA: To urządzenie żelowe działa z dużą mocą i użytkownicy powinni zachować ostrożność.
   7. Dokładnie wypłukać studzienki za pomocą strzykawki.
      nuta: Ten krok ma kluczowe znaczenie dla równomiernego załadunku próbki do studzienek.
   8. Pulse spin wygaszone reakcje. Następnie inkubować probówki w temperaturze 75 °C przez 3 minuty. Powtórz wirowanie impulsowe.
   9. Natychmiast załadować 10 μl próbki do studzienki i uruchomić żel przez 3 godziny przy 50 W.
      nuta: Znakowane fluorescencyjnie RNA jest wrażliwe na światło; Dlatego przykryj aparat żelowy folią.
4. Wyobraź sobie żel denaturujący.
   1. Wyłącz zasilanie i opróżnij górną komorę aparatu żelowego.
   2. Umyj i osusz zewnętrzną stronę kanapki ze szklaną płytą wodą z mydłem. Przykryj kanapkę ze szklaną płytą folią podczas transportu żelu.
   3. Zamontuj kanapkę ze szklaną płytką na stoliku skanera laserowego zdolnego do ilościowej i czułej detekcji fluorescencji.
      nuta: Ten żel jest niezwykle cienki, co zapewnia maksymalną rozdzielczość. Z tego powodu protokół ten ma na celu uniknięcie trudności z usuwaniem żelu z kanapki ze szklaną płytką poprzez bezpośrednią wizualizację znakowanego fluorescencyjnie RNA przez szklane płytki. Zastosowanie dostępnych na rynku płytek szklanych o niskiej fluorescencji zwiększy przechwytywany sygnał poprzez poprawę stosunku sygnału do szumu.
   4. Ustaw długości fal wzbudzenia i emisji skanera laserowego dla żądanego fluoroforu.
      nuta: Optymalne długości fal wzbudzenia i emisji mogą się różnić dla konkretnych fluoroforów. Dla fluoroforu FAM długości fal wzbudzenia i emisji wynoszą odpowiednio 495 nm i 535 nm.
   5. Zdefiniuj obszar do wizualizacji na stoliku skanera laserowego i zobrazuj żel zgodnie z instrukcjami producenta (rysunek 1).

Wyniki

Figure 1: Przykład analizy żelu denaturującego fosforylowanego RNA. Test in vitro kinazy RNA Las1-Grc3 (110 nM) inkubowany z 500 nM SC-ITS2 RNA. X oznacza reakcję kontrolną bez Las1-Grc3, a trójkąt reprezentuje miareczkowanie ATP w zakresie 0-10 mM. C2 RNA jest wynikiem rozszczepienia...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Grzebień 34-dołkowy 0,4 mm	Przedsiębiorstwo BioRad	1653848
Podkładka dystansowa 0,4 mm	Przedsiębiorstwo BioRad	1653812
0,5 M EDTA ph 8,0	Firma KD Medical	Przekaźnik RGF-3130
1M chlorek magnezu	Firma KD Medical	CAC-5290 (wersja cAC-5290
1M Tris pH 8,0	Firma KD Medical	Kontroler RGF-3360
40% akrylamid/bis roztwór 29:1	Przedsiębiorstwo BioRad	1610146
5M Chlorek sodu	Firma KD Medical	Przekaźnik RGF-3720
nadsiarczan amonu (APS)	Przedsiębiorstwo BioRad	Numer katalogowy: 161-0700
Atp	Sigma	A2383-1G
Kwas borowy	Sigma	Zobacz materiał B0394
Sól sodowa błękitu bromofenolowego	Sigma	B5525-5G
Talerze szklane	Thomas Naukowy	Numer katalogowy: 1188K51
Sekwencer Hoefer SQ3	Hoefer	N/a
Oprogramowanie Image J	N/a	N/a	https://imagej.nih.gov/ij/
Znakowane oligonukleotydy RNA	Identyfikator IDT	Na zamówienie
Zasilacz Pharmacia EPS 3500	Farmacja	N/a
Filtr Steriflip 0. 22 um	Milipory	5FCP00525
TEMED	Przedsiębiorstwo BioRad	161-0800
Baza Tris	Sigma	TRIS-RO
Imager żelowy Typhoon FLA 9500	GE Opieka zdrowotna	N/a
Ultra czysta woda DEPC	Invitrogen	750023
Ultra czysty glicerol	Invitrogen	Numer katalogowy: 19E1056865
mocznik	Fisher Chemiczny	U15-500

) powiedział: TGL TGL