Dwuwymiarowa elektroforeza w żelu agarozowym częściowo denaturującym: technika rozdzielania polimorficznych włókien amyloidowych na podstawie niejednorodności wielkości

Streszczenie

Źródło: Hanna-Addams, S., et al. Użycie dwuwymiarowej elektroforezy żelu agarozowego z półdenaturującym detergentem w celu potwierdzenia niejednorodności wielkości włókien amyloidowych lub amyloidopodobnych. J. Vis. Exp. (2018).

Ten film demonstruje dwuwymiarową, częściowo denaturującą separację włókien amyloidowych za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym detergentu. Technika ta polega na oddzieleniu polimorficznych agregatów amyloidowych na podstawie ich niejednorodnego rozmiaru.

Protokół

1. Przygotuj próbki

1. Hodowla 2 x 10⁶ komórek raka jelita grubego HT-29 wytwarzających amyloid w 10-centymetrowym naczyniu do hodowli tkankowej w 10 ml zmodyfikowanego podłoża Eagle (DMEM) firmy Dulbecco, zawierającego 10% płodowej surowicy bydlęcej i penicyliny-streptomycyny. Hodować komórki przez noc w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO_{2 .}
   1. Po tym, jak komórki osiągną 80% zlewności, umyj je 10 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Dodać 3 ml roztworu trypsyny i inkubować w temperaturze 37 °C przez 3 minuty.
   2. Po całkowitym odłączeniu komórek od naczynia dodać 10 ml pożywki hodowlanej i przenieść komórki za pomocą pipety o pojemności 10 ml do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Odwirować komórki przy 1 000 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej. Odessać pożywkę, ponownie zawiesić komórki w 5 ml pożywki hodowlanej i policzyć komórki za pomocą licznika komórek. Talerz 2 x 10 6 komórek w każdej z dwóch 10-centymetrowych naczyń.
   3. Pozostawić komórki do przylegania i zregenerować się przez noc w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO₂ . Zastosuj leczenie do jednego naczynia, aby wywołać tworzenie amyloidów za pomocą 20 ng / ml czynnika martwicy nowotworu alfa (TNF-α), 100 nM Smac-mimetyku i 20 μM inhibitora pan-kaspazy Z-VAD-FMK. Kombinacja jest w skrócie TSZ. Drugą potrawę z pojazdem traktuj jako kontrolę.
2. Po upływie odpowiedniego czasu, zwykle 6 godzin, należy pobrać lizat komórkowy.
   1. Zeskrob komórki z płytki za pomocą plastikowego skrobaka i za pomocą pipety o pojemności 10 ml przenieś do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Odwirować komórki w temperaturze 1 000 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C.
   2. Przemyć komórki 2 razy, ponownie zawieszając w 10 ml lodowatego PBS i odwirowując przy 1 000 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C. Odessać roztwór PBS.
      nuta: W tym miejscu proces można wstrzymać, zamrażając osad komórkowy w ciekłym azocie i przechowując go w temperaturze ˗80 °C przez okres do 1 miesiąca.
   3. Przenieś osad komórkowy do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i inkubuj w 0,3 ml buforu do lizy przez 30 minut na lodzie. Wirować przy 20 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Supernatantem jest lizat całego komórki.
      nuta: W tym miejscu proces można wstrzymać, przechowując próbkę w temperaturze -20 °C przez okres do kilku miesięcy.
   4. Zmierz stężenie białka za pomocą testu Bradforda. Dodać 4x bufor ładujący SDD-AGE, aby przygotować 20 μl próbki 3 μg/μL i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.

2. Przygotuj i uruchom żele

1. Dodaj 2 g agarozy do 200 ml 1x buforu tris-octanowego (TAE) w szklanej zlewce i podgrzej w kuchence mikrofalowej, aby rozpuścić agarozę. Dodaj 1 ml 20% SDS, aby uzyskać końcowe stężenie 0,1% SDS. Ostrożnie zamieszaj, aby wymieszać. Uważaj, aby nie generować bąbelków po dodaniu SDS.
2. Wlej roztwór agarozy do płyty żelowej o wymiarach 15 cm x 14 cm. Użyj pipety o pojemności 1 ml, aby usunąć wszelkie pęcherzyki. Umieść jeden 20-dołkowy grzebień na górze.
3. Pierwszy wymiar: Odpipetować 60 μg lizatu pełnokomórkowego na skrajnym prawym pasie. Uruchom żel pod napięciem 60 V przez około 4 godziny (do momentu, gdy czoło barwnika przejdzie przez żel w około 3/4), używając TAE zawierającego 0,1% SDS jako buforu bieżącego.
4. Drugi wymiar: Ostrożnie obróć żel o 90° w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara (Rysunek 1A). Uruchom żel pod napięciem 60 V przez około 4 godziny
   nuta: Ogólne warunki pracy to długość żelu 4 V/cm. Ważne jest, aby warunki pracy były dokładnie takie same dla pierwszego i drugiego wymiaru.

Wyniki

Rysunek 1. Protokół eksperymentalny.(A) Schemat dwuwymiarowej, półdenaturującej elektroforezy w żelu agarozowym (2D SDD-AGE). Zacznij od załadowania próbki na skrajny prawy pas, oznaczony na czerwono. Po zakończeniu pierwszego przebiegu wymiarowego obrócić żel o 90° w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara. Uruchom elektroforezę drugiego wymiaru. Strzałka pełna wskazuje kierunek przebiegu pierw...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Urządzenie do elektroforezy żelowej	rybak	HE99XPRO	Appratus do biegania żelowego.
Agrose	Firma VWR	Numer katalogowy: 97062-250	Do żelu agarozowego.
DMEM (DMEM)	Sigma	Zobacz materiał D6429	do hodowli komórkowej
płodowa surowica bydlęca	Sigma	Zobacz materiał F4135	do hodowli komórkowej
Penicylina-Streptomycyna	Sigma	Zobacz materiał P4333	do hodowli komórkowej
Roztwór trypsyny	Sigma	Zobacz materiał T4049	do hodowli komórkowej
PBS do hodowli tkankowych	Sigma	Zobacz materiał D8662	do hodowli komórkowej
rekombinowany TNF	Wyprodukowano w naszym laboratorium		do wywoływania nekroptozy. Patrz odniesienie 11.
smac-mimetic (smac-mimetyczny)	prezent od dr Xiaodong Wang		do wywoływania nekroptozy. Patrz odniesienie 11.
ZVAD-FMK	ApexBio (ApexBio	Wersja robocza A1902	do wywoływania nekroptozy. Patrz odniesienie 11.
Licznik komórek	Bio-Rad	1450102	Model TC20; do zliczania komórek
Zestaw do oznaczania białek Pierce™ BCA	Thermo Scientific	Numer katalogowy: 23225	do pomiaru stężenia białek w lizatach komórkowych
Podnośnik komórek	rybak	07-200-364	Aby usunąć komórki z naczynia
Bufor do lizy (1 l)			20 ml 1 M Tris pH 7,4 10 ml glicerolu 30 ml 5 M NaCl 840 ml ddH2O 10 ml Triton-X100 (inhibitory proteazy i fosforanów według uznania)
10X TAE (1 L)			48,4 g Tris baza 11,42 ml lodowatego kwasu octowego 20 ml 0,5 M EDTA pH 8 ddH20 do 1 l
4x bufor ładujący SDD-AGE (50 mL)			5 ml 10X TAE 10 ml glicerolu 4 ml 20% SDS 0,5 ml 10% błękitu bromofenolowego 31 ml ddH2O
Bufor do płukania PBST (1 l)			100 ml 10xPBS 800 ml ddH2O 1 ml Tween20
10X PBS (10 l)			800 g NaCl 20 g KCl 144 g Na2HPO4·2H2O 24 g KH2PO4 dodać ddH2O do 10 L

powiedział: powiedział: TGL )