Multimer-PAGE do separacji natywnych kompleksów białkowych: hybrydowa technika separacji składająca się z Blue native-PAGE i SDS-PAGE w celu oddzielenia nienaruszonych białek multimerycznych od lizatu tkankowego

Abstract

Źródło: Rhinesmith, T. et al., Multimer-PAGE: Metoda wychwytywania i rozwiązywania kompleksów białkowych w próbkach biologicznych. J. Vis. Exp. (2017).

Ten film opisuje multimeryczną STRONĘ do oddzielania natywnych kompleksów białkowych od homogenatów tkankowych. Technika ta jest hybrydą niebieskich technik native-page i SDS-PAGE. Oddzielone kompleksy można scharakteryzować i zbadać pod kątem ich roli w funkcjonowaniu komórki.

Protocol

1. Przygotowanie tkanek

1. Przygotować 10 ml 4x BN-PAGE bufor do próbek (200 mM Bis(2-hydroksyetylo)amino-tris(hydroksymetylo)metanu (Bis-Tris), 200 mM NaCl, 40% w/v glicerolu, 0,004% Pąs, pH 7,2).
   nuta: Roztwór podstawowy można przygotować z wyprzedzeniem i przechowywać w temperaturze 4 °C.
2. Rozcieńczyć 250 μl 4x buforu próbki w 750 μL dH₂O zawierającym 1x komercyjny koktajl inhibitorów proteazy. Wiruj i schładzaj na lodzie.
3. Homogenizować 20 mg tkanki docelowej w 1 ml 1x lodowato zimny bufor do próbek BN-PAGE za pomocą 30 pociągnięć czystego homogenizatora z dounce.
   nuta: W tym eksperymencie demonstracyjnym tkanką docelową jest cała tkanka mózgowa szczura. Po homogenizacji próbki można poddać działaniu łagodnego detergentu, takiego jak 2% digitonina, w celu rozpuszczenia i umożliwienia elektroforezy białek błonowych.
4. Przenieś homogenat do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i odwiruj przy 14 000 x g przez 30 minut, aby uzyskać nierozpuszczalną zawartość komórkową. Po odwirowaniu zdekantować supernatant do czystej probówki na lodzie.
5. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta, aby zmierzyć stężenie białka sklarowanego nad osadem za pomocą kwasu bicinchoninowego (BCA) lub podobnego testu ilościowego białka.
6. Jeśli próbka homogenatu zawiera detergent, dodać 5% Coomassie Blue G-250 do roztworu wodnego wystarczającą do doprowadzenia roztworu homogenatu do 0,25% Coomassie.

2. BN-PAGE

1. Rozcieńczyć 25 ml 20x niebieski natywny (BN) bufor do elektroforezy (1,0 M Bis-Tris, 1,0 M tricine, pH 6,8) w 475 ml dH₂O zawierającym 0,002% Coomassie Blue, aby uzyskać 500 ml 1x działającego buforu.
   1. Jeśli próbki zawierają detergent, zamiast tego przygotuj 250 ml 1x buforu biegowego zawierającego 0,02% Coomassie i kolejne 250 ml nie zawierającego żadnego.
2. Schłodzić bufor(-y) do temperatury 4 °C.
3. Wyczyść i zmontuj kasetę do nalewania żelu poliakryloamidowego zgodnie z instrukcjami producenta.
4. Wlać żel poliakrylamidowy BN (3% T warstwa rozdzielcza, 6% T warstwa rozdzielcza) według standardowej receptury i umieścić grzebień studzienki.
5. Po polimeryzacji żeli przepłukać kasetę_dH2Oi zmontować aparat do elektroforezy zgodnie z instrukcjami producenta.
6. Wyjmij grzebień studzienki i napełnij studzienki buforem roboczym 1x BN-PAGE. Unikaj napełniania całej komory wewnętrznej buforem do czasu załadowania próbek.
   1. Jeśli próbki zawierają detergent, napełnij studzienki buforem zawierającym 0,02% Coomassie Blue.
      UWAGA: Wykonaj kroki 2.7-2.9 w temperaturze 4 °C.
7. Za pomocą końcówek do ładowania żelem odpipetować objętość homogenatu zawierającego 20 μg białka do żądanych studzienek. Odpipetować równoważną objętość 1x bufor próbki BN-PAGE do wszystkich nieużywanych studzienek.
   nuta: Użyć stężenia białka oznaczonego na podstawie testu BCA, aby obliczyć odpowiednią objętość homogenatu, który należy dodać do studzienek.
8. Po załadowaniu próbek napełnij komorę wewnętrzną buforem roboczym 1x BN-PAGE. Upewnij się, że żel jest całkowicie zanurzony w buforze. Następnie należy napełnić komorę zewnętrzną buforem roboczym 1x do poziomu wskazanego przez producenta.
   1. Jeśli próbki zawierają detergent, napełnij komorę wewnętrzną 1x buforem zawierającym 0,02% Coomassie Blue, a komorę zewnętrzną 1x bezbarwnym buforem do biegania.
9. Podłącz elektrody do źródła zasilania i elektroforezuj białka w żelu pod napięciem 150 V, aż pasmo barwnika przesunie się ~2 cm w warstwę rozdzielczą. Zatrzymaj i odłącz zasilanie.

3. Sieciowanie

UWAGA: Wykonaj kroki 3.1-3.6 w temperaturze 4 °C.

1. Zdemontuj aparat do elektroforezy i oddziel tafle szkła kasety żelowej. Usuń i wyrzuć warstwę układania.
2. Ostrożnie przetnij żel tuż pod dolną krawędzią frontu barwnika. Uważaj, aby to cięcie było tak gładkie i proste, jak to tylko możliwe, a następnie wyrzuć niewykorzystany kawałek żelu. Spowoduje to pozostawienie poziomego paska żelu poliakrylowomidowego o szerokości ~2 cm, który będzie zawierał całe białko w jednorodnej próbce.
3. Odetnij wszelkie niewykorzystane części wzdłuż krawędzi paska żelu.
4. Ostrożnie umieść pasek w 10 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) w małym pojemniku i delikatnie mieszaj przez nutację przez 30 minut, aby zrównoważyć.
5. Po zrównoważeniu wyrzuć i zastąp PBS innymi 10 ml. Odpipetować 500 μl 25 mM DSP rozpuszczonego w dimetylosulfotlenku do PBS i kontynuować mieszanie jak powyżej (krok 3.4) przez 30 minut.
6. Odlej roztwór DSP. Dodać 10 ml 0,375 M chlorowodorku tris(hydroksymetylo)aminometanu (Tris-HCl) o pH 8,8, zawierającego 2% dodecylosiarczanu sodu (SDS) w celu wygaszenia nieprzereagowanego DSP. Kontynuuj nutację przez 15 minut.

4. STRONA SDS

1. Podczas hartowania paska żelu przygotuj roztwory żelu SDS-PAGE zgodnie ze standardowymi metodami. Nie dodawać odczynników do polimeryzacji.
2. Po schłodzeniu przywróć pasek żelu ΒΝ do temperatury pokojowej i wlej pasek do nowej kasety żelowej.
   1. Aby to zrobić, ostrożnie podnieś żel i umieść go na czystej płytce dystansowej kasety żelowej.
   2. Ustaw pasek tak, aby dolna część przodu barwnika znajdowała się najbliżej górnej części nowej kasety (tj. strona, która podróżowała najdalej podczas BN-PAGE, powinna znajdować się najbliżej górnej części nowej kasety; pasek żelu powinien zostać odwrócony od poprzedniej orientacji). Zobacz rysunek 1.
   3. Umieść pasek w taki sposób, aby jego górna krawędź leżała równo z miejscem, w którym będzie znajdować się górna krawędź płytki osłonowej (tj. będzie znajdować się na górze nowego żelu). Upewnij się, że przód barwnika jest równoległy do poziomych krawędzi szklanej płytki.
   4. Dociśnij jedną stronę wyciętego paska do jednej ze ścianek dystansowych, pozostawiając miejsce po drugiej stronie na wylanie żelu i załadowanie wzorca białkowego lub drabinki.
   5. Jeśli dolna krawędź paska żelowego zawiera jakiekolwiek postrzępione lub nierówne obszary, ostrożnie je odetnij. Jeśli są obecne, będą zatrzymywać pęcherzyki podczas nalewania żelu.
   6. Po prawidłowym umieszczeniu paska żelowego połóż płytkę osłonową na płycie dystansowej. Delikatnie dociśnij, aby wypchnąć uwięzione pęcherzyki powietrza.
   7. Kontynuuj montaż urządzenia do nalewania żelu zgodnie z instrukcjami producenta.
3. Dodać odczynniki polimeryzacyjne do rozdzielczego buforu żelowego i wlać go do przygotowanej kasety żelowej za pomocą pipety serologicznej. Napełnij kasetę z żelem do ~2 cm poniżej wyciętego paska żelu BN-PAGE, aby pozostawić miejsce na warstwę do układania.
4. Dodać 100 μl butanolu na wierzch wylanego żelu i odczekać 30 minut na polimeryzację warstwy rozdzielczej. Odlej butanol.
5. Dodać odczynniki polimeryzacyjne do roztworu żelu do układania. Za pomocą pipety serologicznej wlej warstwę stosu, aby wypełnić całą pozostałą pustą przestrzeń w kasecie z żelem.
   1. Przechyl kasetę z żelem podczas wylewania warstwy układania w stos, tak aby wypełniła przestrzeń pod paskiem żelu, a pęcherzyki powietrza nie zostały uwięzione.
   2. Gdy bufor żelu do układania w stos wypełni pustą przestrzeń pod paskiem żelu, stopniowo przywróć kasetę z żelem do poziomej podstawy.
   3. Kontynuuj wypełnianie pustej przestrzeni obok wyciętego paska żelu buforem żelu do układania w stos, aż prawie się przeleje.
6. Pozostawić warstwę układającą do polimeryzacji przez 30 min.
   nuta: Wykonaj 10x bufor do pracy SDS-PAGE (250 mM tris(hydroksymetylo)aminometan (tris), 1,9 M glicyny, 1% SDS) podczas polimeryzacji żelu. Można to również zrobić wcześniej i przechowywać w temperaturze pokojowej.
7. Rozcieńczyć 50 ml 10x bufor do pracy SDS-PAGE w 450 ml dH₂O, aby uzyskać 1x bufor roboczy.
8. Po polimeryzacji warstwy układającej należy wyjąć kasetę z żelem z aparatu do nalewania, spłukać_dH2Oi zmontować aparat do elektroforezy zgodnie z instrukcjami producenta.
9. Napełnij całkowicie komorę wewnętrzną buforem biegowym 1x SDS-PAGE, a następnie napełnij komorę zewnętrzną do poziomu wskazanego przez producenta.
10. Załaduj przestrzeń obok wyciętego paska żelu drabinką o masie cząsteczkowej lub odpowiednim wzorcem białka.
11. Podłącz elektrody do zasilacza i poddaj próbki elektroforezie pod napięciem 120 V. Gdy barwnik Coomassie spłynie z żelu, zatrzymaj się i odłącz zasilanie.
12. Analizuj żel przy użyciu standardowych metod elektroblottingu i wykrywania białek poprzez wiązanie przeciwciał.

Results

Rysunek 1: Ogólny schemat blokowy multimeru PAGE.
(A) Przygotować lizat tkankowy przy użyciu metod niedenaturujących, takich jak homogenizacja w buforze próbki BN-PAGE. (B) Odpipetować lizę do żelu BN-PAGE, a następnie przeprowadzić elektroforezę (150 V) w buforze BN-PAGE. Pozwól próbce migrować, aż czoło barwnika przesunie się o ~2 cm do żelu rozdzielczego. (C) U...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
chemikalia
Kwas ε-aminokapronowy	Sigma	Ciągnik siodłowy A2504
Akrylamid	Acros Organics	164855000	toksyczny.
Akrylamid/bisakryloamid 37,5:1 (40% T roztwór podstawowy)	Przedsiębiorstwo BioRad	Numer katalogowy: 161-0148	toksyczny.
Nadsiarczan amonu	Sigma	A3678
Anty królicze IgG-HRP z kóz	Biotechnologia Santa Cruz	SC-2004
Zestaw do oznaczania kwasu bicunchoninowego	Rybak termiczny	Numer katalogowy: 23225
Bis-tris	Sigma	Zobacz materiał B9754
Albumina surowicy bydlęcej	Sigma	A9647 (wersja angielska
butanol	Fisher Naukowy	Samolot A399-1
Zestaw substratów chemiluminescencyjnych	Rybak termiczny	Numer katalogowy: 24078
Coomassie niebieski G-250	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał B0770
Digitonina	Sigma	Zobacz materiał D141	toksyczny.
Dimetylosulfotlenek	Fisher Naukowy	Zobacz materiał D128-1
Ditiobis (sukcynimidylopropionian)	Thermo Scientific	Numer katalogowy: 22585
Mleko odtłuszczone w proszku	Laboratorium Naukowe	Zobacz materiał M0841
glicerol	Sigma	Zobacz materiał G9012
glicyna	Fisher Naukowy	Zobacz materiał BP381-5
Koktajl inhibitorów proteazy Halt	Rybak termiczny	Numer telefonu 78430
kwas solny	Fisher Naukowy	A144SI-212	Do miareczkowania. Kaustyczny.
metanol	Fisher Naukowy	A412-4	Do aktywacji membrany PVDF. Toksyczny.
Monoklonalna anty α-synukleina IgG z królika	Biotechnologia Santa Cruz	SC-7011-R
N,N,N',N'-tetrametyloetylenodiamina	Sigma	Zobacz materiał T9281
N,N'-metylenobisakryloamid	Acros Organics	Numer katalogowy: 16479	toksyczny.
NP40	Produkty biologiczne Boston	Zobacz materiał P-872
Polisorbat 20 (tween-20)	Fisher Naukowy	Zobacz materiał BP337-500
Membrany przenoszące z polifluorku winylidenu	Thermo Scientific	Numer katalogowy: 88518
Pąsek S	Sigma	Zobacz materiał P3504
Chlorek potasu	Fisher Naukowy	Zobacz materiał P217-3
Fosforan potasu jednozasadowy	Sigma	Zobacz materiał P9791
Koktajl inhibitorów proteazy	Thermo Scientific	Numer katalogowy: 88265
Roztwór SDS (10% w/v)	Przedsiębiorstwo BioRad	Numer katalogowy: 161-0416
chlorek sodu	Fisher Naukowy	Zobacz materiał BP358-212
Dodecylosiarczan sodu	Sigma	L37771
Sodu fosforan jednozasadowy	Fisher Naukowy	Zobacz materiał BP329-1
Trykot	Sigma	Zobacz materiał T0377
Baza Tris	Fisher Naukowy	Zobacz materiał BP152-500
Tris-HCl (bufor 0,5 M, pH 6,8)	Przedsiębiorstwo BioRad	Numer katalogowy: 161-0799
Tris-HCl (1,5 M bufor, pH 8,8)	Przedsiębiorstwo BioRad	Numer katalogowy: 161-0798
Instrumentów
GE Imagequant LAS 4000	GE Opieka zdrowotna	28-9558-10
Oprogramowanie ImageJ NIH
Czytnik mikropłytek Synergy H1	BioTek
Forma żelu + stojak	Biorad
Wirówka Microfuge 22R	Beckman Coulter
2 ml homogenizatora z beczki
Mieszalnik wirowy	Fisher Naukowy
Ultradźwiękowy homogenizator tkanek	Fisher Naukowy	FB120220