Elektroforeza w żelu agarozowym amplikonów DNA po PCR: metoda analizy produktów multiplex PCR i oceny powodzenia reakcji PCR

Abstract

Źródło: Gulla, S. et al. Multi-locus Zmienna liczba Tandem-repeat Analiza bakterii patogennej dla ryb Yersinia ruckeri za pomocą Multiplex PCR i elektroforezy kapilarnej. J. Vis. Exp. (2019 rok)

W tym filmie demonstrujemy separację DNA z amplifikacją bakteryjną metodą PCR za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. Żel agarozowy działa jak sito molekularne, umożliwiając migrację ujemnie naładowanego DNA w zależności od ich wielkości pod wpływem przyłożonego pola elektrycznego.

Protocol

1. Potwierdzenie amplikonu PCR za pomocą elektroforezy żelowej

1. Zgodnie z zaleceniami producenta należy przygotować objętość 1,5% (w/v) żelu agarozowego w 1x buforze tris-boran-EDTA (TBE) odpowiednią do liczby badanych reakcji PCR. Przed odlewaniem dodać 5 μl barwnika fluorescencyjnego kwasu nukleinowego na 50 μl roztworu żelu i wymieszać. Do odlewania należy używać tacek i grzebieni, pozostawiając odpowiednią liczbę dołków wolnych na drabinki referencyjne DNA.
2. Po związaniu zanurz żel w 1x buforze TBE w systemie GE. Wymieszać 5 μl produktu PCR z 2 μl barwnika ładującego i przenieść do dołków żelowych. Dodaj 5 μl drabinki DNA do pu....

Results

Rysunek 1: Elektroforeza żelowa sprawdzająca obecność wielu produktów PCR. Obraz potwierdza obecność wielu amplikonów PCR we wszystkich 12 liniach zawierających próbki, przy czym pierwsza linia reprezentuje użytą drabinę DNA. Wskazano rozmiary wybranych fragmentów drabiny, a także test PCR i przynależność szczepu każdego toru.

....

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agaroza, uniwersalny, peqGOLD	Firma VWR	732-2789P/732-2788
Bufor tris-boranu-EDTA (TBE)	nie	nie	Standardowa receptura; produkowana we własnym zakresie.
Barwnik ładujący żel DNA (6X)	Thermo Fisher Naukowy	Czynnik R0611
System elektroforezy żelowej	Zgodnie z preferencjami	nie
Barwienie kwasem nukleinowym GelRed, 10 000X w wodzie	Biot	Numer katalogowy: 41003	Fluorescencyjny barwnik kwasu nukleinowego
GeneRuler 50 bp Drabinka DNA, gotowa do użycia	Thermo Fisher Naukowy	Zobacz materiał SM0373	Drabina DNA
System obrazowania/wizualizacji żelu na bazie promieniowania UV	Zgodnie z preferencjami	nie