Elektroforeza kapilarna: technika analizy znakowanych fluorescencyjnie amplikonów reakcji łańcuchowej polimerazy

Streszczenie

Źródło: Gulla, S. et al., Multi-locus Zmienna-liczbowa Tandem-repeat Analysis of the Fish-pathogenic Bacterium Yersinia ruckeri za pomocą Multiplex PCR i elektroforezy kapilarnej. J. Vis. Exp. (2019 rok)

Ten film opisuje technikę elektroforezy kapilarnej do analizy fluorescencyjnie znakowanych amplikonów PCR uzyskanych z różnych próbek na podstawie ich wielkości. Generuje wzór migracyjny, który określa długości par zasad fragmentów za pomocą znakowanego barwnika fluorescencyjnego w każdym fragmencie.

Protokół

1. Konfiguracja i warunki działania elektroforezy kapilarnej

1. Po potwierdzeniu amplikonów PCR, produkty PCR rozcieńczyć w stosunku 1:10 (v/v) w oczyszczonej wodzie. Zamknąć, wymieszać i krótko odwirować.
2. Pracując w dygestorio, przygotować objętość mieszanki wzorcowej składającej się z 9 μl formamidu i 0,5 μl wzorca wielkości na produkt PCR (pozostawić 10% nadwyżki objętości). Krótko przemieszać i rozprowadzić 9,5 μl do studzienek na płytce odpowiedniej dla dostępnego systemu CE przed dodaniem 0,5 μl rozcieńczonego produktu PCR. Zamknąć, wymieszać i krótko odwirować.
   UWAGA: Obchodź się ostrożnie. Mieszanie formamidu z wodą powoduje powstawanie kwasu mrówkowego, który jest toksyczny.
3. Za pomocą termocyklera PCR denaturować próbki w temperaturze 95 °C przez 3 minuty, a następnie schładzać do 4 °C w nieskończoność. Odwirować na krótko i załadować płytkę do skalibrowanego systemu CE zgodnie z instrukcjami producenta.
4. Przeprowadzić analizę fragmentów CE przy użyciu odczynników odpowiednich dla wybranej aparatury i następujących ustawień: 60 °C; 5 s iniekcji przy napięciu 1,6 kV (32 V na cm); 32 minuty czasu pracy przy napięciu 15 kV (300 V na cm). Analiza fragmentów CE 24 dołków na 24-kapilarnym (50 cm) trwa zwykle około 50 minut.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Analizator genetyczny Avant 3500xL	Thermo Fisher Naukowy	A30469	Służy do analizy fragmentów elektroforezy kapilarnej.
Barwienie kwasem nukleinowym GelRed, 10 000X w wodzie	Biot	Numer katalogowy: 41003	Fluorescencyjny barwnik kwasu nukleinowego stosowany podczas elektroforezy żelowej.
Oprogramowanie GeneMapper 5	Thermo Fisher Naukowy	4475073	Służy do odczytu elektroferogramów z elektroforezy kapilarnej.
Barwnik GeneScan 600 LIZ Rozmiar Standard v2.0	Thermo Fisher Naukowy	4408399	Wzorzec wielkości stosowany podczas elektroforezy kapilarnej.
Hi-Di Formamid	Thermo Fisher Naukowy	4311320/4440753	Dejonizowany formamid stosowany podczas elektroforezy kapilarnej. Przygotuj płyny robocze.
Woda Milli-Q	nie	nie	Oczyszczona woda używana podczas PCR i elektroforezy kapilarnej. Standardowa receptura; Produkowane we własnym zakresie.
Polimer POP-7 do analizatorów genetycznych 3500 Dx/3500xL Dx	Thermo Fisher Naukowy	A26077/4393713/4393709	Matryca separacyjna stosowana podczas elektroforezy kapilarnej.
System obrazowania/wizualizacji żelu na bazie promieniowania UV	Zgodnie z preferencjami.	nie
Wirownik	Zgodnie z preferencjami.	nie