Elektroforeza w żelu alkalicznym z pojedynczymi komórkami: czuła technika ilościowego szacowania uszkodzeń DNA w poszczególnych komórkach rakowych po chemioterapii

Streszczenie

Źródło: Lu, Y., et al. Ocena uszkodzeń DNA in vitro za pomocą testu komety J. Vis. Exp. (2017)

W tym filmie demonstrujemy alkaliczny test elektroforezy pojedynczej komórki, aby określić ilościowo zarówno jedno-, jak i dwuniciowe pęknięcia DNA w komórkach traktowanych doksorubicyną. Warunki alkaliczne przerywają wiązania wodorowe między parami zasad DNA, co powoduje całkowite odwijanie i rozdzielanie nici DNA. Pozwala to na różnicową migrację nieuszkodzonych i uszkodzonych fragmentów DNA w żelu agarozowym po elektroforezie, odsłaniając strukturę w kształcie komety składającą się z wolno migrującego nieuszkodzonego DNA tworzącego okrągłą głowę komety i szybko migrujących uszkodzonych fragmentów DNA tworzących wydłużony warkocz komety.

Protokół

1. Przygotuj odczynniki

1. 1x PBS (Biblioteka PBS)
   1. Rozcieńczyć 100 ml 10x PBS 900 ml dH₂O i dostosować pH do 7,4 za pomocą pH-metru. Przechowywać w temperaturze pokojowej.
2. Roztwór do lizy (LS)
   1. Przygotować 2,5 M NaCl, 100 mM EDTA disodowego, 10 mM zasady Tris i 200 mM NaOH w 900 ml dH₂O; zwykle potrzeba około 20 minut, aby mieszanina całkowicie się rozpuściła. Dostosuj pH do 10 za pomocą pH-metru. Dodaj 1% laurylosarkozynianu sodu i 1% Triton X-100 i dostosuj końcową objętość do 1 000 ml. Schłodzić do 4°C przez co najmniej 30 minut przed użyciem.
3. Alkaliczny roztwór do elektroforezy (AES), pH >13
   1. Przygotować 200 mM NaOH i 1 mM EDTA disodowego w 800 ml dH₂O. Dostosuj pH i upewnij się, że wynosi pH >13. Dostosuj końcową objętość do 1,000 ml. Przygotuj świeże przed użyciem i schładzaj do 4°C przez co najmniej 30 minut przed użyciem
4. Roztwór do barwienia
   1. 1. Dodaj 1 μL 10 000x zielone fluorescencyjne barwienie kwasem nukleinowym (np. SYBR Green) do 30 ml buforu Tris-EDTA (10 mM Tris-HCl, 1 mM disodowego EDTA, pH 7,4) i przechowuj w temperaturze 4°C. Chronić przed światłem.
5. 1% agarozy niskotopliwej
   1. Rozpuść 1% agarozy o niskiej temperaturze topnienia (1 g w 100 ml dH₂O) w kuchence mikrofalowej. Obracaj agarozę co 15-20 s, aby upewnić się, że agaroza jest całkowicie stopiona. Umieść agarozę w łaźni wodnej o temperaturze 37°C na co najmniej 20 minut przed użyciem.
6. Wstępnie ciepłe końcówki do pipet
   1. Odciąć wąskie końce końcówek pipet P200 o 3 mm i ogrzać w temperaturze 37°C przed pipetowaniem agarozy.

2. Przygotuj slajdy komety

1. Powłoka ślizgowa
   1. Rozpuść 1% agarozy (1 g w 100 ml dH₂O) w kuchence mikrofalowej przez 2 - 3 minuty lub do momentu, gdy agaroza całkowicie się stopi. Zanurz szklane szkiełka mikroskopowe w agarozie i wytrzyj jedną stronę szkiełka za pomocą niestrzępiącej się chusteczki.
   2. Połóż szkiełka na płaskiej powierzchni do wyschnięcia na powietrzu lub podgrzej w temperaturze 50°C w celu szybszego schnięcia; po wyschnięciu powinien powstać przezroczysty film agarozowy. Przed użyciem umieść powlekane szkiełka w temperaturze 37°C.
2. Przygotowanie zawiesin jednokomórkowych
   1. Hodowla i leczenie komórki glejaka
      1. Hoduj komórki U251 MG w pożywce DMEM-Ham F-12 uzupełnionej 10% FBS, 100 U / ml penicyliny i 10 μg / ml streptomycyny w temperaturze 37 ° C z 5% CO₂ .
      2. Trawić komórki za pomocą 1 ml trypsyny przez 3 minuty i neutralizować trypsynę za pomocą pożywki DMEM-Ham F-12 z FBS. Zebrać do probówki o pojemności 15 ml, wirować w temperaturze 300 x g przez 4 minuty, odessać pożywkę i zawiesić komórki w temperaturze 2 x 10⁵ komórek/ml w 1x PBS.
         nuta: Próbka komórkowa powinna być przygotowana bezpośrednio przed rozpoczęciem testu, a wszystkie próbki powinny być obsługiwane w ciemnym lub przyciemnionym środowisku, aby zapobiec uszkodzeniom DNA przez światło.
      3. Połączyć zawiesinę komórek z 1% stopioną agarozą o niskiej temperaturze topnienia (w temperaturze 37°C) w stosunku 1:10 (v/v), delikatnie wymieszać, pipetując w górę i w dół, a następnie natychmiast odpipetować 30 μl na szkiełko pokryte agarozą. Użyj boku końcówki pipety, aby rozprowadzić mieszaninę agarozy i komórek, aby zapewnić utworzenie cienkiej warstwy.
      4. Umieść szkiełko płasko w temperaturze 4°C w ciemności na 10 minut. Wydłużenie czasu żelowania do 30 minut poprawia przyczepność próbek w środowisku o wysokiej wilgotności.
      5. Zanurz zjeżdżalnię w 4°C LS w ciemności na 1 godzinę do nocy.
3. Elektroforeza jednokomórkowa
   1. Do alkalicznego testu kometa
      1. Delikatnie wyjmij szkiełka z LS, opróżnij nadmiar buforu i delikatnie zanurz w AES na 1 godzinę w temperaturze 4°C, aby umożliwić rozwinięcie DNA. Trzymaj slajdy w ciemności.
      2. Dodaj wstępnie schłodzony AES do tacki na szkiełka do elektroforezy, nie przekraczaj 0,5 cm nad szkiełkami (zależy to od wielkości jednostek do elektroforezy), umieść szkiełka w środku i przykryj nakrętką. Ustaw napięcie zasilania na 1 V/cm (długość między elektrodami) i pracuj przez 30 minut w temperaturze 4°C.
      3. Spuść nadmiar roztworu elektroforetycznego ze szkiełka. Delikatnie zanurz szkiełka dwukrotnie w dH₂O na 5 minut każde w temperaturze pokojowej.
      4. Delikatnie zanurz szkiełka w 70% etanolu na 5 minut w temperaturze pokojowej. Przejdź do barwienia.
4. Szkiełka Bejca Comet
   1. Suszyć szkiełka w temperaturze 37°C przez 10 - 15 minut w ciemności.
   2. Umieść 50 - 100 μl zielonego fluorescencyjnego roztworu do barwienia kwasów nukleinowych na każdej wysuszonej agarozie i barwić przez 15 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
   3. Szkiełka należy krótko przepłukać w temperaturze dH₂O i całkowicie wysuszyć w temperaturze 37°C w ciemności. Przejdź do akwizycji i analizy obrazu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
10x PBS (wolne od Ca++, Mg++)	TEKnova	Zobacz materiał P0196
Zawartość NaCl	Sigma	Zobacz materiał S5886
Edta	TEKnova	E0308
Baza Trizma	Sigma	Zobacz materiał T1503
NaOH	Sigma	Numer katalogowy: 72068
Laurylosarkozynian sodu	Sigma	L7414
Tryton X-100	Sigma	Numer katalogowy: 93443
SYBR Zielony	Invitrogen	S33102
Agaroza o niskiej temperaturze topnienia	Invitrogen	Numer katalogowy: 16520
Agarozy	Invitrogen	16500
95% etanolu	WARNERA-GRAHAMA	#64-17-5
trypsyna	GIBCO (Przedsiębiorstwo GIBCO)	25300-054
Szkiełka bibułkowe szklane	MIKROSKOPIA ELEKTRONOWA	Nr kat. 63422-11
Chusteczki Kimwipes	KIMberly-Clark
Probówki do mikrowirówek 1,5 ml	Denville
Końcówki do pipet	ostry
kuchenka mikrofalowa	Avanti
Kąpiel wodna	precyzja
Pozioma komora do elektroforezy	TREVIGEN	Kometa ES II
zasilacz	Bio-Rad
inkubator	Laboratorium Quincy	Wzór 12-140E
Mikroskop fluorescencyjny	Zeiss	Zobacz materiał LSM700
Mikropipetor	Eppendorf