1. Blokowanie wolnych reszt cysteiny za pomocą jodoacetamidu
- Hoduj komórki U-2 OS w naczyniu o średnicy 6cm2 do 50%-60% zbiegu w minimalnej niezbędnej pożywce o wysokiej zawartości glukozy zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej i 1% pirogronianu sodu w temperaturze 37 °C w 5% CO2 .
- Przygotuj świeży zapas 10 mM jodoacetamidu tuż przed użyciem, a następnie wyrzuć niewykorzystany odczynnik.
- Dodać 0,1 mM jodoacetamidu o stężeniu końcowym bezpośrednio do pożywki do hodowli komórkowych. Delikatnie kołysz naczyniem w temperaturze pokojowej przez 2 minuty.
2. Zbieranie komórek
- Odessać pożywkę z komórek.
- Umyj komórki trzykrotnie 5 ml zimnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Odessać końcowy roztwór płuczący PBS, a następnie dodać 1 ml zimnego PBS.
- Zeskrob komórki z dna naczynia za pomocą skrobaka do komórek. Za pomocą pipety o pojemności 1 ml pobrać PBS i zawiesinę komórek, a następnie dozować cały płyn do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
- Wirować komórki w temperaturze 7 500 x g przez trzy minuty w temperaturze 4 °C. Odessać PBS, pozostawiając osad komórkowy. Osad komórkowy może być przechowywany w temperaturze -80 °C do czasu przetworzenia
3. Ekstrakcja białka
- Przygotować 100 μl 1x buforu do lizy rozcieńczonego w ddH2O (patrz tabela materiałów). Dodać fluorek fenylometylosulfonylu (PMSF) bezpośrednio przed użyciem do końcowego stężenia 1 mM.
- Dodaj 50 μl 1x buforu do lizy bezpośrednio do osadu komórkowego i zawiesić. Inkubuj to na lodzie przez 5 minut.
- Sonikować przez 8 s w trybie stałego impulsu na poziomie 40% (patrz Tabela Materiałów dla sonikatora; dostosować w razie potrzeby dla różnych sonikatorów), utrzymując ekstrakt na lodzie.
- Wirować ekstrakt w temperaturze 4 °C przez 5 minut w temperaturze 16 000 x g. Supernatantem jest rozpuszczalna frakcja białkowa. W razie potrzeby można przeprowadzić analizę Bradforda w celu określenia stężenia białka.
4. Przygotowanie próbki
- Weź 10 μl rozpuszczalnego ekstraktu białkowego i dodaj 10 μl 1x buforu do próbek Laemmli SDS (4% SDS, 20% glicerol, 0,004% błękitu bromofenolowego i 0,125 M Tris-HCl, pH 6,8). Nie dodawaj żadnych odczynników redukujących.
- Próbki należy przechowywać na lodzie, jeżeli tego dnia ma być przeprowadzona analiza SDS PAGE; w przypadku długotrwałego przechowywania właściwe jest -20 °C. Bezpośrednio przed uruchomieniem żelu należy podgrzewać próbkę przez 5 minut w temperaturze 85 °C.
5. Sieciowanie in vivo formaldehydu białek endogennych w komórkach U-2 OS
- Hoduj komórki U-2 OS w kolbie o średnicy 175cm2 do 70%-80% konfluencji.
- Przeprowadź reakcję sieciowania formaldehydu
- W dygestorium podamy porcję 37% roztworu formaldehydu zakupionego ze źródeł komercyjnych. Utrwalacz formaldehydu dodać bezpośrednio do podłoża do końcowego stężenia 1% i inkubować w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem przez 15 minut.
- Aby wygasić reakcję, dodać 1,25 M glicyny do końcowego stężenia 0,125 M i inkubować w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem na kołysku przez 5 minut.
- Umyj komórki trzykrotnie 5 ml zimnego PBS. Zassać końcowy roztwór płuczący PBS i dodać 10 ml PBS. Zeskrobać komórki z dna kolby za pomocą skrobaka do komórek.
- Za pomocą pipety o pojemności 10 ml pobrać PBS i zawiesinę komórek, a następnie dozować cały płyn do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Wirować komórki w temperaturze 500 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C. Odessać PBS, pozostawiając osad komórkowy.
6. Frakcjonowanie jąder
- Przygotować 10 ml buforu homogenizacyjnego: 0,25 M sacharozy, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES i 0,5% BSA przy pH 7,4. Dodać PMSF bezpośrednio przed użyciem do 1 mM końcowego stężenia i 3 ml buforu zawiesiny jąder (0,1% Triton X-100 w PBS).
- Dodać 5 ml buforu homogenizacyjnego bezpośrednio do osadu komórkowego i całkowicie zawiesić. Odwirować zawiesinę o sile 500 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C, a następnie odrzucić supernatant.
- Zawiesić osad w 5 ml buforu homogenizacyjnego. Użyj ciasno dopasowanego homogenizatora szklano-teflonowego, homogenizuj komórki przy 10 uderzeniach/500 obr./min.
- Odwirować zawiesinę o stężeniu 1 500 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, a następnie odrzucić supernatant.
UWAGA: Użyć supernatantu do izolacji mitochondriów przez odwirowanie przy 10 000 x g przez 10 minut.
- Zawiesić osad w 1 ml buforu zawiesiny jąder i inkubować na lodzie przez 10 minut.
- Wirować przy 600 x g przez 10 min. Wyrzucić supernatant.
- Zawiesić osad w 1 ml buforu zawiesiny jąder i ponownie odwirować. Odrzucić supernatant. Ostatnim osadem będą izolowane jądra.
7. Ekstrakcja białka
- Powtórzyć sekcję 4, z wyjątkiem dodania 25 μl 1x buforu do lizy bezpośrednio do osadu komórkowego, a następnie zawieszenia.
8. Przygotowanie próbki
- Przygotować dwie próbki do SDS-PAGE, pobierając po 10 μl rozpuszczalnego ekstraktu białkowego i dodając 10 μl 2x buforu do próbek Laemmli SDS i 1 μl 2-merkaptoetanolu (BME).
- Ogrzewać jedną próbkę przez 5 minut w temperaturze 37 °C, a drugą próbkę przez 15 minut w temperaturze 98 °C w celu odwrócenia usieciowania formaldehydu.
9. Analiza SDS-PAGE
- Przygotuj 1 l 1x buforu do biegania Tris-glicyna (25 mM Tris, 192 mM glicyny, 0,1% (w/v) SDS).
- Skonfiguruj urządzenie do uruchamiania SDS-PAGE.
UWAGA: Ten protokół wykorzystuje 16% prefabrykowaną stronę SDS TGX. Warto zauważyć, że można użyć dowolnego żelu procentowego.
- Zgodnie z protokołem producenta otwórz opakowanie, w którym przechowywany jest żel, i wyjmij kasetę.
- Usuń grzebień wyściełający studzienki i taśmę z dna kasety.
- Umieść żel w aparacie do biegania.
- Napełnij komorę 1x działającym buforem, aż studzienki zostaną zanurzone w cieczy. Za pomocą plastikowej pipety wypłucz studzienki za pomocą działającego bufora.
- Załaduj próbki na żel wraz z 10 μl wstępnie wybarwionego markera standardowego.
- Uruchom żel pod napięciem 200 V, aż przód barwnika znajdzie się około 1 cm od dna żelu.
